一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用。所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。利用本发明专利技术所述打靶载体对猪GHR基因进行靶向敲除，敲除效率可达到12.7％，将GHR基因敲除成功的体细胞通过体细胞核移植技术还可进一步构建GHR基因敲除猪模型，为研究GHR基因的生理作用和分子机制提供材料。

【技术实现步骤摘要】
一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及敲除GHR基因的猪细胞系的制备方法。
技术介绍
莱伦氏综合征(Laronsyndrome)是一种生长激素受体(Growthhormonereceptor,GHR)突变造成的罕见常染色体隐性遗传病。这一突变造成生长激素通过GHR的信号转导出现障碍，进而影响胰岛素样生长因子1(Insulinlikegrowthfactor1,IGF1)的产生，最终影响生长激素对机体的促生长、代谢、发育作用。该病主要病症是(1)侏儒；(2)体内低水平的生长激素，高水平的IGF1。目前临床上主要通过给患者补充IGF1来治疗该疾病，但长期补充IGF1不可避免的会产生一系列的副作用，例如肥胖、低血糖、头痛、颅内高血压、淋巴结肿胀和雄激素增多等。随着研究人员对该病的研究，发现罹患该病的患者具有极低几率患癌症的特点，多发展为脂肪肝，并且以GHR缺陷的小鼠为研究对象，发现GHR缺陷可能与肥胖、低血脂症、心血管等疾病相关。为了研究莱伦氏综合征的致病机理及筛选治疗药物，人们建立大量的小鼠模型，用于研究GHR在繁殖、生长、糖脂代谢、寿命和肥胖等方面的作用。但由于小鼠与人存在的差异，在研究骨骼生长和脂肪代谢方面与人类差别巨大。而猪与人具有相似的大小和生理状态，猪的器官发育及疾病进展也与人类似，并且猪的基因组序列及染色体结构与人具有高度同源性，更有利于疾病机理的探究。因此，急需提供一种可高效构建GHR敲除猪疾病模型的方法，为莱伦氏综合征的治疗提供良好的研究基础。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体及其应用，所述打靶载体可实现对猪GHR基因的高效敲除。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。作为优选，所述靶标序列符合5′-N(20)NGG-3′的排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G中的任意一个碱基。所述sgRNA表达载体是将sgRNA的靶标序列的5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的初始载体相连接。优选所述初始载体为本领域常用的pX330。进一步优选，靶标序列位于猪GHR基因第10外显子的sgRNA序列如下：U1-F：caccgTCATATAGTACAGTCTCCAC；U1-R：aaacGTGGAGACTGTACTATATGAc；靶标序列位于猪GHR基因3′UTR区sgRNA序列如下：D3-F：caccgAATAGGGCTAGGAAGGAGGC；D3-R：aaacGCCTCCTTCCTAGCCCTATTc。本专利技术还进一步提供了所述打靶载体在制备猪GHR基因敲除细胞或GHR基因敲除猪方面的应用。所述应用具体表现为，利用本专利技术所述打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞，或进一步将获得的GHR基因敲除的细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。所述体细胞系为成纤维细胞系或肾细胞系，为后续验证更为方便，选取增殖能力较好的猪肾细胞系进行实验。本专利技术还提供了一种制备猪GHR基因敲除细胞的方法，将前述打靶载体转染猪体细胞系，筛选获得GHR基因敲除的细胞。本专利技术还提供了一种制备GHR基因敲除猪的方法，将前述打靶载体转染猪成纤维细胞系，筛选获得GHR基因敲除的成纤维细胞，并将所获得的GHR基因敲除的成纤维细胞，通过体细胞核移植技术制备GHR基因敲除猪。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术采用新型基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统，在中国实验用小型猪(ChineseExperimentalMinipig,CEMP)GHR基因上及其附近设计敲除靶位点，利用构建好的GHR基因敲除打靶载体，通过电击法转染猪肾细胞系，筛选获得GHR基因敲除的猪肾细胞共71个克隆，其中GHR敲除纯合子克隆1个，杂合子克隆8个，敲除效率达到12.7％。在此基础上，还可进一步筛选GHR基因敲除的成纤维细胞系，通过体细胞核移植技术获得GHR基因敲除猪。本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用CRISPR/Cas9系统能够快速高效地将目的基因大片段敲除，且不留下外源基因片段。本专利技术利用CRISPR/Cas9系统可以快速高效的构建GHR基因敲除猪模型，为研究GHR基因的生理作用和分子机制提供材料，通过观察GHR基因敲除猪的生理生化指标，以及转录组分析等，研究人员可以更深入地对GHR基因的作用机制和机理展开探究。附图说明图1为实施例1中针对GHR基因第10外显子和3′UTR设计的基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体在猪成纤维细胞中的突变效率验证，其中U1、U2、U3、D1、D2、D3表示所设计sgRNA的T7E1酶切实验；WT表示未转染猪成纤维细胞PCR产物。图2为实施例1中绿色荧光观察电击转染效率。图3为实施例1中细胞单克隆荧光素酶活性分析。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的pEGFP载体和pX330载体为Addgene公司产品。实施例1本实施例采用CRISPR/Cas9技术制备猪GHR基因敲除细胞，具体实验步骤如下：一、表达载体构建所用骨架载体为pX330载体，针对部分第10外显子设计U1-U3sgRNA，针对3′UTR设计D1-D3sgRNA，此外为了区分是部分第10外显子缺失或3′UTR区缺失造成侏儒表型，在第10外显子第一个polyA之后设计M1-M4sgRNA，其中sgRNA表达载体具体构建过程如下：将表1中每个靶序列的两条寡核苷酸片段稀释到200mM后混合，退火形成双链，连接到经BbsI酶(NEB(USA)公司)酶切后得到的pX330骨架载体上，并测序验证得到序列正确的10个重组载体。表1靶向猪GHR基因的sgRNA序列二、载体效率验证通过电击法将构建好的10个重组载体分别和pEGFP载体共转入猪胎儿成纤维细胞(12CEPEF2)中，检验各载体的靶点相对切割效率，实验重复三次。72小时后收集细胞，提取基因组，用高保真KOD-Plus对上游和中游靶点使用Exon10-F1/R1进行PCR扩增。对下游靶点使用Exon10-F2/R2进行PCR扩增。利用Surveyor法(错配酶法)—T7ENI酶(NEB(USA)公司)酶切验证，通过跑PAGE胶来检测Px330载体骨架上sgRNA的突变效率。结果表明设计的M1-M4靶点没有发生突变，上游和下游本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。

【技术特征摘要】
1.一种用于敲除猪GHR基因的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，其中，sgRNA的靶标序列分别位于猪GHR基因的第10外显子和3′UTR上。2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述靶标序列符合5′-N(20)NGG-3′的排列规则，其中N(20)表示20个连续的碱基，每个N表示A或T或C或G中的任意一个碱基。3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述sgRNA表达载体是将sgRNA的靶标序列的5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的初始载体相连接。4.根据权利要求3所述的打靶载体，其特征在于，所述初始载体为pX330。5.根据权利要求1～4任一项所述的打靶载体，其特征在于，靶标序列位于猪GHR基因第10外显子的sgRNA序列如下：U1-F：caccgTCATATAGTACAGTCTCCAC；U1-R：aaacGTGGAGACTGTACTATATGAc...

【专利技术属性】
技术研发人员：张然，韩琪，陈慧玲，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11