一种构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法技术

本发明专利技术提供了一种构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，包括：在小鼠受精卵时期利用胚胎显微注射技术胞浆注射甲基化载体以及靶向MeCP2基因TSS区的gRNA载体，得到自闭症谱系障碍的小鼠模型；其中，所述的甲基化载体含有dCas9片段以及人源DNMT3L和DNMT3A催化功能域。本发明专利技术的定点甲基化载体，可以有效实现细胞中的位点特异的甲基化。

【技术实现步骤摘要】
一种构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法
本专利技术涉及一种小鼠体内位点特异甲基化的技术，属于表观基因编辑领域，更具体的说涉及基于CRISPR系统与甲基转移酶融合，并结合胚胎显微注射技术进行在体MeCP2基因特异甲基化来构建自闭症谱系障碍的小鼠模型。该技术同时也可用于模拟和构建因其他基因发育过程中甲基化异常而引起的生理状态变化的小鼠模型，和在体干预表观修饰异常引起的疾病。
技术介绍
自闭症谱系障碍(Autismspectrumdisorders，ASD)是一类复杂的神经疾病，影响了1.5％的新生儿童。ASD患者有社交障碍，焦虑和重复刻板行为等症状。ASD有很强的遗传因素和临床异质性。超过400个基因被证明与ASD有关。然而，现在没有确定的基因突变能在大多数的ASD病人中被证明1，同时，越来越多的证据表明环境因素在ASD的发病进程中起到重要作用2。例如，同卵双生的两个个体拥有几乎完全相同的基因组序列信息，但在同卵双生患者的ASD病例中，两个个体是否发病和个体之间的发病进程有很大差异，这些结果都暗示了非遗传因素(环境因素)可能在ASD中起到重要作用3。环境因素对ASD影响的可能的作用机制是表观修饰的异常，例如，DNA甲基化和组蛋白甲基化的异常。事实上，ASD的相关基因，例如MeCP2，Fmr1和Shank3等，的DNA甲基化异常已经在ASD病人中被报道4-10。MeCP2编码的甲基化CpG结合蛋白2(methylatedCpG-bindingprotein2)是可以结合上甲基化的CpG位点的转录抑制因子。MeCP2蛋白的功能丧失或功能获得(Lossorgainoffunction)性突变都会导致RTT综合征或自闭症。ASD患者通常被诊断带有智力障碍，自闭，发育迟缓等症状。正如我们所说ASD有很强的遗传因素的同时，现在也有越来越多的证据说明表观修饰异常在ASD中具有重要作用。MeCP2启动子区的异常高甲基化和MeCP2蛋白的表达量降低已经在ASD患者的额叶皮层中被检测到7，8。同时，我们利用ASD病人的外周血在，病人中可以观察到MeCP2基因的转录起始位点(transcriptionstartsites，TSS)区域的异常高甲基化。然而，MeCP2基因的甲基化和ASD表型之间的直接因果关系还未被证明和建立。为了达到这一目的和建立甲基化异常导致的自闭症小鼠模型就必须在实现体内位点特异的甲基化。自从2013年利用CRISPR/Cas9第一次对哺乳动物细胞进行基因编辑以来11，12，基因编辑这个领域被摆到了最显眼的位置。CRISPR/Cas系统是来源于细菌和古细菌免疫系统，由RNA介导的可靶向特异性核苷酸序列的核酸内切酶系统，其中来源为化脓性链球菌的Cas9蛋白(SpCas9)使用最为广泛。RNA介导的Cas9起作用主要依靠gRNA和Cas9蛋白所形成的复合物，Cas9与gRNA复合物首先识别2-4个碱基的protospacer临近模块(protospacer-adjacentmotif，PAM)。PAM高度保守地存在于靶向序列的5’端或3’端。一旦复合物结合上PAM，DNA双链打开，与gRNA互补配对，随后发生切割。例如SpCas9就由RuvC和HNH功能域在PAM序列上游第三和第四个碱基之间造成基因组双链断裂。随着断裂基因组的修复，在双链断裂位点会随机丢失或插入碱基，造成开放阅读框移码突变，从而达到敲除基因的目的。失去切割DNA活性的dCas9蛋白保留了与gRNA形成复合物和结合特异性核苷酸序列的能力，dCas9蛋白融合一系列表观修饰因子后可以做为有效操作特异位点表观修饰的工具。2016年陆续有实验室报道利用dCas9进行了体内和体外的定点甲基化和去甲基化13-16。这为我们的研究提供了理论基础。参考文献1.Woodbury-Smith，M.&Scherer，S.W.Progressinthegeneticsofautismspectrumdisorder.DevMedChildNeurol60，445-451(2018).2.Pacchierotti，F.&Spano，M.EnvironmentalImpactonDNAMethylationintheGermline：StateoftheArtandGapsofKnowledge.BiomedResInt2015，123484(2015).3.Wong，C.C.etal.Methylomicanalysisofmonozygotictwinsdiscordantforautismspectrumdisorderandrelatedbehaviouraltraits.MolPsychiatry19，495-503(2014).4.Strong，E.etal.SymmetricalDose-DependentDNA-MethylationProfilesinChildrenwithDeletionorDuplicationof7q11.23.AmJHumGenet97，216-27(2015).5.ElagozYuksel，M.，Yuceturk，B.，Karatas，O.F.，Ozen，M.&Dogangun，B.Thealteredpromotermethylationofoxytocinreceptorgeneinautism.JNeurogenet30，280-284(2016).6.Zhu，L.etal.EpigeneticdysregulationofSHANK3inbraintissuesfromindividualswithautismspectrumdisorders.HumMolGenet23，1563-78(2014).7.Nagarajan，R.P，Hogart，A.R.，Gwye，Y.，Martin，M.R.&LaSalle，J.M.ReducedMeCP2expressionisfrequentinautismfrontalcortexandcorrelateswithaberrantMECP2promotermethylation.Epigenetics1，e1-11(2006).8.Nagarajan，R.P.etal.MECP2promotermethylationandXchromosomeinactivationinautism.AutismRes1，169-78(2008).9.NicholEdamura，K.&Pearson，C.E.DNAmethylationandreplication：implicationsforthe″deletionhotspot″regionofFMR1.HumGenet118，301-4(2005).10.Stoger，R.，Kajimura，T.M.，Brown，W.T.&Laird，C.D.EpigeneticvariationillustratedbyDNAmethylationpattemsofthefragile-XgeneFMR1.HumMolGenet6，1791-801(1997).11.Cong，L.etal.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，包括：在小鼠受精卵时期利用胚胎显微注射技术胞浆注射甲基化载体以及靶向MeCP2基因TSS区的gRNA载体，得到自闭症谱系障碍的小鼠模型；其中，所述的甲基化载体含有dCas9片段以及人源DNMT3L和DNMT3A催化功能域。

【技术特征摘要】
1.一种构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，包括：在小鼠受精卵时期利用胚胎显微注射技术胞浆注射甲基化载体以及靶向MeCP2基因TSS区的gRNA载体，得到自闭症谱系障碍的小鼠模型；其中，所述的甲基化载体含有dCas9片段以及人源DNMT3L和DNMT3A催化功能域。2.如权利要求1所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，所述的甲基化载体通过将人源DNMT3L和DNMT3A的催化功能域连接至dCas9蛋白N端形成。3.如权利要求1所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，所述的甲基化载体的序列为SEQIDNO：11。4.如权利要求1所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，所述的靶向MeCP2基因TSS区的gRNA载体含有至少一条靶向MeCP2基因特异位点的gRNA片段。5.如权利要求1所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法还包括：在小鼠受精卵时期利用胚胎显微注射技术胞浆注射甲基化对照载体以及靶向MeCP2基因TSS区的gRNA载体，得到自闭症谱系障碍的小鼠对照模型，其中，所述的甲基化对照载体通过突变甲基化载体的DNMT3A催化活性位点得到。6.如权利要求1所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，所述的甲基化对照载体的序列为SEQIDNO：14。7.如权利要求1或5所述的构建自闭症谱系障碍的小鼠模型的方法，其特征在于，所述的显微注射的条件为20-80ng/μl甲基化载体或甲基化对...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆宗阳，刘真，黄行许，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：上海,31