一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用技术

技术编号:19712216 阅读:22 留言:0更新日期:2018-12-08 18:18
本发明专利技术涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造技术领域,提供了一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法,包括如下步骤:目标序列选取,构建含嵌合抗原受体的pCDH载体,将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中,慢病毒的包装,表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备。本发明专利技术还提供了上述表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在实体瘤免疫治疗方向上的应用。本发明专利技术的优点在于:提供了一种表达乙酰肝素酶HPSE的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用,其表达的HPSE可以提高免疫细胞在肿瘤微环境中的迁移能力,为实体瘤的治疗提供了新的思路和途径。

【技术实现步骤摘要】
一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗技术与基因工程改造
,尤其涉及一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用。
技术介绍
过继细胞疗法(ACT)是抗癌的新型工具。用于表达嵌合抗原受体(CARs)的T细胞已经证实了显著的临床疗效,特别是一些血液系统恶性肿瘤(MaudeSL,2014;PorterDL,2015;GarfallAL,2015)。CARS是由细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号转导/激活域组成的合成分子。胞外组分由来自抗体的轻链和重链区组成,以形成单链可变片段(scFv),并用于以MHC独立的方式识别和结合特异性肿瘤相关抗原(TAAs)。通常来源于CD8或IgG4分子的铰链结构域将该胞外模块与细胞内的模块连接起来,最后一部分是由负责触发T细胞活化的CD3ζ片段形成的。第二代CARS和第三代CARS分别添加一个或两个共刺激结构域,通常是CD28和/或4-1BB。通过scFv识别抗原,避免了HLA的限制,具有高特异性和有效的激活,CARs表达这些分子已经成为最有前途的癌症治疗方法之一。虽然嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法代表了血液恶性肿瘤(如B-ALL)的革命性治疗,然而,这种治疗还没有在实体瘤中实现成功(PuleMA,2008;BawleyVS,2012)。T细胞治疗实体肿瘤的三大障碍主要是(1)肿瘤相关抗原的识别;(2)过继转移的细胞向肿瘤部位的运输受限;(3)肿瘤微环境的免疫抑制作用。当前,进行实体瘤靶向治疗常用的靶点主要包括EpCAM、HER2以及GPC3等。EpCAM属于单次跨膜I型糖蛋白,EpCAM基因位于人染色体2p21,基因长度14kbp,相对分子量40kDa,其分子结构由胞外结构域、单次跨膜结构域和胞内结构3部分构成,其主要编码一种肿瘤相关抗原,多数表达与正常上皮细胞和上皮源性恶性肿瘤细胞。EpCAM参与调节细胞间粘附、迁移、增殖及信号传导。EpCAM的过表达导致Wnt-β-连环蛋白信号通路这一经典的肿瘤信号通路的激活,通过Wnt级联反应激活原癌基因e-myc和cyclinA/E的表达,诱导细胞的增殖。多项研究证据表明,EpCAM在多种肿瘤组织中呈高水平表达,在肿瘤细胞的增殖中扮演着重要角色,因此EpCAM成为前列腺癌、肝癌等多种癌症免疫靶向治疗的重要靶点。人表皮生长因子受体2(HER2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化,并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。作为预后和预测生物标志物,大约15–30%的乳腺癌和10–30%的胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过表达。HER2的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部。HER2靶向治疗极大的改善了HER2阳性乳腺癌、胃/食管癌患者的预后。Glypican-3(GPC3)蛋白为硫酸肝素糖蛋白家族成员之一,CPC3相对分子质量约为66×103,它富含一段包括14个半胱氨酸残疾的独特序列,在N末端有一种分泌型信号蛋白,C端通过与糖基磷脂酰肌醇共价结合而锚定于细胞膜上,且硫酸乙酰肝素链插入点的位置均由C端最末50个氨基酸决定,是该链靠近细胞膜。CPC3在在调控细胞生长和分化方面起重要作用,与肝癌的发生、发展密切相关,有报道称,肝癌组织中GPC3阳性率达到74.5%。所以GPC3在肝癌组织中特异性高表达的特性,可作为肝癌治疗的新靶点。复杂且异质的肿瘤微环境在肿瘤发生进展和治疗抵抗中起着至关重要的作用。目前,有一些方式改变肿瘤微环境,如氟达拉滨和环磷酰胺减少吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)表达,进而改善CAR-T细胞治疗疗效。或是,通过基因重组技术,让CARs细胞表达抗肿瘤免疫反应的刺激因子,如白细胞介素-12和白细胞介素-18等(KerkarSP,2010)。然而,除了肿瘤微环境外,过继转移细胞的运输受限也是影响细胞治疗效果的重要原因之一。BernfieldM等1999年研究发现T淋巴细胞在转移过程中会主动降解内皮下基底膜和细胞外基质(ECM)中的主要成分,其中包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)。ECM是基质的组成部分,因此侵袭富含基质的实体瘤的T细胞必须能够降解HSPGs以进入肿瘤细胞并发挥抗肿瘤作用。在此过程中,T细胞需要释放特异性酶,即乙酰肝素酶(HPSE),它是唯一已知的能裂解HSPGs硫酸乙酰肝素链的哺乳动物β-D糖苷内切酶。虽然活化的CD4+T淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞和B淋巴细胞可以分泌HPSE,但在肿瘤的微环境中是受限的(IgnazioC,2015)。据此,为了提高细胞在肿瘤微环境中的迁移能力,目前急需通过基因重组技术来构建一种能表达乙酰肝素酶(HPSE)的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法及应用。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题:一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法,包括如下步骤:(1)目标序列选取:选取乙酰肝素酶HPSE的核苷酸序列作为目标序列,其DNA序列如SEQIDNO:1所示;(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体:构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构,整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成;在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端,克隆进入pCDH载体中,得含嵌合抗原受体的pCDH载体;(3)将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中:直接将乙酰肝素酶HPSE表达序列进行合成后,克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体,接着对其进行酶切,随后转染DH5α大肠杆菌,进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定,最终获得含乙酰肝素酶HPSEDNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体;(4)慢病毒的包装:先培养293T细胞,再使用Opti-MEM作为转染试剂,通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含乙酰肝素酶HPSEDNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞;培养一段时间后,进行病毒的收集,并通过超速离心进行浓缩与纯化;(5)表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备:在获取供者的抗凝外周血后,离心去除血浆,获取血细胞,再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后,再转移至CD3/CD28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养;其中,在培养的第2-4天,加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染,即可获得目标所需的表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。作为本专利技术的优选方式之一,所述步骤(1)中通过NCBI官方网站获取乙酰肝素酶HPSE的核苷酸序列作为目标序列。作为本专利技术的优选方式之一,所述步骤(2)中实体瘤特异性抗原靶点具体为:表皮生长因子受体3型突变体EGFRvⅢ、EpCAM上皮细胞粘附分子、人表皮生长因子受体2HER2、白介素13受体α2IL13RA、癌胚抗原CEA、间皮素MSLN、成纤维细胞激本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)目标序列选取:选取乙酰肝素酶HPSE的核苷酸序列作为目标序列,其DNA序列如SEQ ID NO:1所示;(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体:构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构,整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4‑1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成;在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端,克隆进入pCDH载体中,得含嵌合抗原受体的pCDH载体;(3)将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中:直接将乙酰肝素酶HPSE表达序列进行合成后,克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体,接着对其进行酶切,随后转染DH5α大肠杆菌,进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定,最终获得含乙酰肝素酶HPSE DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体;(4)慢病毒的包装:先培养293T细胞,再使用Opti‑MEM作为转染试剂,通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含乙酰肝素酶HPSE DNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞;培养一段时间后,进行病毒的收集,并通过超速离心进行浓缩与纯化;(5)表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备:在获取供者的抗凝外周血后,离心去除血浆,获取血细胞,再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后,再转移至CD3/CD28anti‑body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养;其中,在培养的第2‑4天,加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染,即可获得目标所需的表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)目标序列选取:选取乙酰肝素酶HPSE的核苷酸序列作为目标序列,其DNA序列如SEQIDNO:1所示;(2)构建含嵌合抗原受体的pCDH载体:构建以实体瘤特异性抗原为靶点的嵌合抗原受体结构,整个嵌合抗原受体结构由识别上述实体瘤特异性抗原分子的scFv片段、CD8跨膜区、4-1BB/CD137片段、CD3ζ片段依次顺序连接组成;在上述嵌合抗原受体结构序列的两端加入酶切位点粘性末端,克隆进入pCDH载体中,得含嵌合抗原受体的pCDH载体;(3)将乙酰肝素酶HPSE的DNA表达序列克隆进含嵌合抗原受体的pCDH载体中:直接将乙酰肝素酶HPSE表达序列进行合成后,克隆进入含嵌合抗原受体的pCDH载体,接着对其进行酶切,随后转染DH5α大肠杆菌,进行载体扩增并通过酶切与PCR测序鉴定,最终获得含乙酰肝素酶HPSEDNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体;(4)慢病毒的包装:先培养293T细胞,再使用Opti-MEM作为转染试剂,通过慢病毒包装体系中的质粒与步骤(3)得到的含乙酰肝素酶HPSEDNA表达序列及嵌合抗原受体的pCDH载体来共转染293T细胞;培养一段时间后,进行病毒的收集,并通过超速离心进行浓缩与纯化;(5)表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备:在获取供者的抗凝外周血后,离心去除血浆,获取血细胞,再通过Ficoll试剂进行单个核细胞PBMC的分离后,再转移至CD3/CD28anti-body负载预处理的培养瓶使用含有IL2的KBM581培养基进行培养;其中,在培养的第2-4天,加入步骤(4)制得的慢病毒进行感染,即可获得目标所需的表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。2.根据权利要求1所述的表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中通过NCBI官方网站获取乙酰肝素酶HPSE的核苷酸序列作为目标序列。3.根据权利要求1所述的表达乙酰肝素酶的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中实体瘤特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员:凌发忠韩江萌刘振云徐华栋程丰伟
申请(专利权)人:安徽古一生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:安徽,34

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