一种靶向HER2的CAR-T细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基因编辑的可分泌细胞因子或抗体的CAR‑T细胞制备方法及其用途。一种制备CAR‑T细胞的方法，是将包含基因编辑质粒及CAR修饰的质粒载体转染至T细胞。本发明专利技术的CAR‑T细胞通过基因编辑及基因修饰将T细胞表面负调节基因敲除并将识别肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、分泌细胞因子或分泌抗体的表达框整合到T细胞，并能在T细胞中持续表达，使回输的T细胞避免被肿瘤微环境所抑制，对肿瘤细胞起到更好的杀伤作用。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向HER2的CAR-T细胞的制备方法及应用
：本专利技术属于免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种基于碱基编辑技术修饰靶向HER2的CAR-T细胞制备方法及应用。
技术介绍
：肿瘤免疫治疗是利用人体自身的免疫系统杀伤和抑制肿瘤细胞，与传统方式不同，该方法不直接针对肿瘤，而是通过重新激活人体免疫系统从而对肿瘤起到杀伤抑制作用。2013年，《科学》杂志将肿瘤免疫治疗评为十大科学重大突破。近年来，肿瘤免疫治疗发展迅速，已成为继手术、化疗、放疗外的第四种肿瘤治疗方法。肿瘤过继性细胞免疫治疗，经历了从早期的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)治疗，细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK,DC-CIK)治疗，NK细胞治疗，到肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)治疗，抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)治疗，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。LAK、CIK、NK细胞治疗是非特异性的过继细胞免疫治疗，TIL、CTL、CAR-T细胞治疗为特异性的过继细胞免疫治疗。嵌合抗原受体T细胞CAR-T(chimericantigenreceptorTcell)，是利用基因工程技术将患者T淋巴细胞在体外转染嵌合受体基因，形成对特定抗原有特异性识别能力的效应性T细胞，经过体外扩增后回输到患者体内，回输的CAR-T细胞通过高效特异的非MHC限制性方式识别特定肿瘤细胞表面抗原，并对肿瘤细胞完成杀伤。CAR受体通常编码一个单链抗体scFv(singlechainvariablefragment)以结合肿瘤细胞表面抗原，同时连接有细胞内信号转导结构域，通常为CD28和/或4-1BB共刺激分子及CD3ζ胞内信号域，介导T细胞的活化。CAR-T细胞是不依赖MHC分子而与肿瘤细胞表面抗原直接结合，因此可以绕过T细胞的MHC限制，避免由于肿瘤细胞下调或缺失MHC分子引起的免疫逃逸。Eshhar及其同事在1989年首次提出了CAR的概念，到目前为止，根据CAR结构的演变，可以将其分为四个阶段。第一代CAR受体包含了胞外特异识别受体scFv片段，胞内激活信号CD3ζ或者FcεRIγ的ITAM(immunereceptortyrosine-basedactivationmotifs)信号链。由于第一代CAR缺乏T细胞共刺激信号域，T细胞不能完全被刺激活。第二代CAR在一代CAR的基础上增加了T细胞活化所需的第二信号域，包括CD28,CD134/OX40,CD137/4-1BB,lymphocyte-sepecificproteintyrosinekinase(LCK),induceibleT-cellco-stimulator(ICOS)以及DNAX-activationprotein10(DAP10)等结构域，CD28,4-1BB为常用的胞内第二信号结构域，二代CAR-T细胞增殖能力及肿瘤细胞杀伤能力都有了较大的提升。第三代CAR相较于二代CAR，其胞内第二信号结构域由一个增加到二个，通常由CD28及4-1BB双共刺激结构域组成。三代CAR具有更好的效应功能及体内存活时间。第四代CAR为在三代CAR的基础上增加了具有分泌IL12，IL18等细胞因子功能结构，进一步提高T细胞的增殖杀伤能力。目前，已有2款针对血液肿瘤的CAR-T产品被批准上市。多个针对血液肿瘤的临床试验表明，以CD19、BCMA等血液瘤特异性抗原为靶点的CAR-T细胞针对血液肿瘤展现了很好的疗效，但相比于血液瘤，针对实体瘤的CAR-T临床试验显示的治疗效果并不是很好。其主要原因包括：(1)免疫抑制性的免疫细胞及其分泌的细胞因子起到负调节作用，肿瘤微环境中存在例如调节性T细胞(Tregs)，骨髓源的抑制性细胞(MDSC)，肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)或者肿瘤相关性的中性粒细胞(TAN)，其分泌的相关细胞因子，如IL6、IL10、IDO、VEGF等可以通过直接或者间接的方式抑制效应性T细胞的功能；(2)负调节因子阻碍T细胞识别肿瘤细胞，T细胞表面的免疫检查点分子PD-1及其肿瘤细胞表面的PD-L1分子表达水平升高，PD-1与PD-L1的相互作用抑制了T细胞对肿瘤细胞的识别杀伤；另一方面，T细胞表面的负调节因子(如IDO、TIM3等)同样会阻碍到T细胞的杀伤效应功能；通过制备PD-1、TIM3分子敲出的CAR-T细胞，及制备具有分泌免疫正调节因子(如IL12、IL18)的CAR-T细胞可以在一定程度上解除该负调节效应，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别杀伤；(3)缺乏合适的CAR-T治疗靶点，靶点的选择是实体瘤CAR-T治疗的另一项挑战，B细胞血液瘤中CD19的表达几乎是100％，然而实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者的不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗陷入缺乏理想的靶点，限制了CAR-T细胞在治疗实体瘤上的应用。目前，应用双靶点的CAR-T细胞是实体瘤治疗的一个研究方向。目前，在体外对T细胞进行修饰的手段主要是通过逆转录病毒、慢病毒、腺病毒及质粒电转，利用腺病毒载体(非整合)可以介导外源基因在T细胞内高水平的表达，但是活化后的T细胞增殖速度非常快，携带有外源基因的T细胞在增殖过程中快速丢失。利用逆转录病毒或慢病毒介导外源基因在T细胞中的整合表达是目前主要的手段，但是慢病毒及逆转录病毒载体所能携带的外源编码框都较短，且制备保存存在较大的困难。以sleepingbeauty、piggybac质粒等转座子系统为主的外源基因导入系统可以介导较长外源基因的整合且制备保存比较简单的优点。传统的真核生物靶向基因操作是通过全能胚胎干细胞的同源重组和囊胚注射实现的。由于受到建立全能胚胎干细胞这一限制，主要是小鼠(也有大鼠的报道)可以通过全能胚胎干细胞的同源重组完成基因靶向改造[Capecchi,2005]。进行基因靶向操作的另一种途径是克隆，即体细胞的基因改造和核移植。不过，克隆技术存在一些缺陷[Carteretal.,2002；Zhuetal.,2004]。比如，终末分化的体细胞克隆后很难完全去分化成未分化细胞，影响胚胎发育，造成发育缺陷；再如，所有的遗传物质仅为母源；另外还有成功率低等，传统的基因靶向操作技术制约了基因敲除。为解决上述技术的弊端，已有中国专利CN201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向PD-1基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术，达到特异性敲除PD-1基因的目的。再如中国专利CN201710991908.7公开了一种编码抗BCMA嵌合抗原受体的基因和包含有该基因重组表达载体，还公开了一种靶向骨髓瘤BCMA抗原的转基因T细胞，其制备方法：gRNA、CRISPR-cas9mRNA、HDR混合，电转重组T细胞，该专利技术在CAR-T构建中，引入了EGFR的识别序列，必要时可用EGFR单抗Cetuximab消除CAR-T细胞，并且敲除了PD1、CTLA4基因，解除了其对CAR-T细胞的抑制，增强了CAR-T细胞克服肿瘤微环境抑制免疫细胞功能。可编程核酸内切酶技术包括锌指核酸酶(zinc-fingernucleases,ZFNs)技术和转录激活因子样效应物核酸酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备敲除了目标基因且能分泌功能蛋白的靶向特定抗原的CAR‑T细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)准备PBMC细胞、并分选富集CD3阳性T细胞；(2)将BE3质粒、sgRNA质粒和引入了编码功能蛋白基因的CAR质粒共转染步骤(1)制得的CD3阳性T细胞后，得转染后的CD3阳性T细胞；(3)在步骤(2)制得的转染后的CD3阳性T细胞中加入IL‑2和CD3/CD28免疫磁珠，激活T细胞；(4)收集步骤(3)激活的T细胞，并进行基因型分析验证，即可制得敲除了目标基因且能分泌功能蛋白的靶向特定抗原的CAR‑T细胞；所述的目标基因为T细胞基因中的人PD1、LAG3、TIGIT、VISTA、2B4或CD160中的任意一种；所述的特定抗原为CD19、CD20、CD23、CD30、CD33、CD123、CD133、PSMA、HER2、VEGF、MSLN、MUC1、GPC3、CEA、EGFRVIII或c‑met中的任意一种；所述的功能蛋白为细胞因子或者抗体；所述的抗体是免疫检查点抑制剂抗体，针对以下抗原中的任意一种：PD‑1、PD‑L1、CTLA4、LAG3或TIM3；所述的细胞因子为IL12，IL18或IL15中的任意一种；所述的sgRNA质粒为含有sgRNA序列的质粒，具体的，所述的sgRNA序列为以下序列，其中粗体下划表示PAM，斜体下划表示候选突变编码子：针对人PD1(hPD‑1)sgRNA为：SEQ ID NO.1:...

【技术特征摘要】
1.一种制备敲除了目标基因且能分泌功能蛋白的靶向特定抗原的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)准备PBMC细胞、并分选富集CD3阳性T细胞；(2)将BE3质粒、sgRNA质粒和引入了编码功能蛋白基因的CAR质粒共转染步骤(1)制得的CD3阳性T细胞后，得转染后的CD3阳性T细胞；(3)在步骤(2)制得的转染后的CD3阳性T细胞中加入IL-2和CD3/CD28免疫磁珠，激活T细胞；(4)收集步骤(3)激活的T细胞，并进行基因型分析验证，即可制得敲除了目标基因且能分泌功能蛋白的靶向特定抗原的CAR-T细胞；所述的目标基因为T细胞基因中的人PD1、LAG3、TIGIT、VISTA、2B4或CD160中的任意一种；所述的特定抗原为CD19、CD20、CD23、CD30、CD33、CD123、CD133、PSMA、HER2、VEGF、MSLN、MUC1、GPC3、CEA、EGFRVIII或c-met中的任意一种；所述的功能蛋白为细胞因子或者抗体；所述的抗体是免疫检查点抑制剂抗体，针对以下抗原中的任意一种：PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3或TIM3；所述的细胞因子为IL12，IL18或IL15中的任意一种；所述的sgRNA质粒为含有sgRNA序列的质粒，具体的，所述的sgRNA序列为以下序列，其中粗体下划表示PAM，斜体下划表示候选突变编码子：针对人PD1(hPD-1)sgRNA为：SEQIDNO.1:SEQIDNO.2:SEQIDNO.3:针对人LAG3(hLAG3)sgRNA为：SEQIDNO.4:SEQIDNO.5:SEQIDNO.6:针对人TIGIT(hTIGIT)sgRNA为：SEQIDNO.7:针对人VISTA(hVISTA)sgRNA为：SEQIDNO.8:针对人2B4sgRNA为：SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：许先进，辛雨，
申请(专利权)人：苏州茂行生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32