靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法技术

技术编号:19712204 阅读:27 留言:0更新日期:2018-12-08 18:17
本发明专利技术公开一种靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,向含有polyQ表达序列的细胞中转染入含有第一向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒,以及含有第二向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒;其中:所述第一向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于ATXN3基因9号内含子所含有的如下结构:5’‑GNx‑NGG‑3’;所述第二向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于所述ATXN3基因10号外显子所含有的如下结构:5’‑GNx‑NGG‑3’;N代表A、T、C、G中的任一种;x为19或者20。该方法一次性完成扩展突变型polyQ序列的敲除,并且效果稳定,不破坏ATXN3基因的功能片段。

【技术实现步骤摘要】
靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法
本专利技术涉及基因改造
,特别涉及一种靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法。
技术介绍
多聚谷氨酰胺类(polyglutamine,polyQ)疾病是一组常见的神经退行性疾病,它是由各自致病基因编码区CAG异常重复扩增并编码多聚谷氨酰胺肽链而致病。目前已经发现包括亨廷顿病、脊髓延髓肌萎缩症、齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩及脊髓小脑共济失调1型(spinocerebellarataxia,SCA1)、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7及SCA17在内的9种多聚谷氨酰胺疾病。PolyQ疾病患者多为成年起病,主要表现为进展性的神经系统功能障碍,除脊髓延髓肌萎缩症外,其余8种PolyQ疾病的发病年龄及病情的严重程度与CAG重复扩增的长度相关。其中SCA3是发病率最高的显性遗传性脊髓小脑共济失调,其致病基因ATXN3基因中10号外显子区的CAG重复数由正常的12-44突变到52-86导致了编码的ATXN3蛋白羧基端多聚谷氨酰胺链异常扩展以及蛋白质的异常聚集,引起细胞功能障碍,从而引起神经毒性而致病。迄今为止,针对此类疾病的研究从未停止,但是具体的发病机制仍然知之甚少,有效的治疗手段也仅仅是对症治疗。传统技术一般针对编码区增多的CAG重复数进行干预。例如,采用RNA干扰,外显子跳跃等技术去减少病变型ATXN3基因的表达,从而缓解疾病表型,但是这些方法有所局限如特异性不高,表达不恒定等。还有传统技术采用反义寡核苷酸链沉默过度增长的polyQ序列或者外显子跳跃掉包含polyQ序列的10号外显子,从而达到在细胞或动物模型中缓解疾病表型的目的,但是这些方法存在如下问题:目的序列针对性不够高,容易对非ATXN3基因中目的序列造成非特异性的干扰;干扰效果不持久,需要合适的浓度和次数才能达到一定的干扰效果。
技术实现思路
基于此,有必要研发一种特异性高、干扰持久并且对ATXN3基因的正常结构和功能不会造成破坏的靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法。一种靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,包括向含有扩展突变型polyQ序列的细胞中转染入含有第一向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒,以及含有第二向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒;其中:所述第一向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于ATXN3基因9号内含子所含有的如下结构:5’-GNx-NGG-3’;所述第二向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于所述ATXN3基因10号外显子所含有的如下结构:5’-GNx-NGG-3’;N代表A、T、C、G中的任一种;x为19或者20。在其中一些实施例中,所述第一向导RNA的序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示;所述第二向导RNA的序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。在其中一些实施例中,所述细胞为iPSCs。在其中一些实施例中,所述Cas9质粒为PX458。在其中一些实施例中,所述转染中,含有第一向导RNA的Cas9质粒、含有第二向导RNA的Cas9质粒、细胞的比例为(4.8-5.2)μg∶(4.8-5.2)μg∶(0.5-1.5)×106个。用于靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的向导RNA,包括第一向导RNA、第二向导RNA;所述第一向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于ATXN3基因9号内含子所含有的如下结构:5’-GNx-NGG-3’;所述第二向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于所述ATXN3基因10号外显子所含有的如下结构:5’-GNx-NGG-3’;N代表A、T、C、G中的任一种;x为19或者20。在其中一些实施例中,所述第一向导RNA的序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示;所述第二向导RNA的序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。用于靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的融合质粒,包括上述的含有第一向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒,以及含上述的第二向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒。与现有技术相比,本申请具备如下有益效果:专利技术人经过长期的实验和研究,结合ATXN3基因的特性,针对ATXN3基因的9号内含子、10号外显子分别设计具有非常好靶向性的向导RNA,特别是SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的第一向导RNA、如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的第二向导RNA,第一向导RNA能够特异性地通过碱基互补配对与9号内含子所含序列结合并与Cas9核酸酶的共同作用下于扩展突变型polyQ序列的上游形成第一双链切口,第二向导RNA能够特异性地通过碱基互补配对与10号外显子所含序列结合并与Cas9核酸酶的共同作用下于扩展突变型polyQ序列的下游形成第二双链切口,第一双链切口与第二双链切口之间的区域被切除,最后再通过细胞自身的DNA修复功能,可一次性完成扩展突变型polyQ序列的敲除;不会对非ATXN3基因中目的序列造成非特异性的干扰,也还不破坏ATXN3基因中功能片段的结构,确保最终细胞的生物功能(例如增殖能力、分化能力等)不受影响;本专利技术属于对ATXN3基因扩展突变型polyQ序列的永久性干扰,能够彻底去除polyQ序列,效果稳定,所得细胞传代10代后分子表型与理论预期结果保持一致。附图说明图1是围绕人ATXN3基因CAG序列设计的gRNA1和gRNA2序列并进行目的切割的示意图;图2是验证gRNA1和gRNA2切割效率和脱靶效应结果图。图3是验证筛选到的目的克隆结果图。图4是筛选到的目的克隆干细胞多能性和分化能力的验证结果图。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法作进一步详细的说明。为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
,特举以下实施例详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂,均为市售产品。除非另有定义,本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。实施例1步骤1、获取SCA3病人来源的iPSCs知情告知并签署知情同意书后,抽取SCA3病人外周血并分离单个核细胞,取约1.5×105细胞,对应CytoTune2.0重编程试剂盒(LifeTechnologies)中相应试剂诱导生成iPSCs,计作SCA3-iPSCs。步骤2、制备含有第一向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒以及含有第二向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒(1)设计向导RNA于述ATXN3基因的9号内含子定位筛选5’-GNx-NGG-3’(N代表A、T、C、G中的任一种;x为19或者20)本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,其特征在于,包括:向含有扩展突变型polyQ序列的细胞中转染入含有第一向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒,以及含有第二向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒;其中:所述第一向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于ATXN3基因9号内含子所含有的如下结构:5’‑GNx‑NGG‑3’;所述第二向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于所述ATXN3基因10号外显子所含有的如下结构:5’‑GNx‑NGG‑3’;N代表A、T、C、G中的任一种;x为19或者20。

【技术特征摘要】
1.一种靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,其特征在于,包括:向含有扩展突变型polyQ序列的细胞中转染入含有第一向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒,以及含有第二向导RNA、Cas9核酸酶表达基因的质粒;其中:所述第一向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于ATXN3基因9号内含子所含有的如下结构:5’-GNx-NGG-3’;所述第二向导RNA能够通过碱基互补配对靶向结合于所述ATXN3基因10号外显子所含有的如下结构:5’-GNx-NGG-3’;N代表A、T、C、G中的任一种;x为19或者20。2.根据权利要求1所述的靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,其特征在于,所述第一向导RNA的序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示;所述第二向导RNA的序列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。3.根据权利要求1或2所述的靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,其特征在于,所述细胞为iPSCs。4.根据权利要求1或2所述的靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,其特征在于,所述质粒为PX458。5.根据权利要求1或2所述的靶向敲除ATXN3基因中扩展突变型polyQ序列的方法,其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员:孙筱放欧阳曙明宋兵杨翌冼业星
申请(专利权)人:广州医科大学附属第三医院广州重症孕产妇救治中心广州柔济医院
类型:发明
国别省市:广东,44

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