本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN‑CAS9‑RGR。本发明专利技术利用CRISPR/CAS9技术结合RGR高效转化水稻敲除相关基因得到一种载体，该载体被命名为pCXUN‑CAS9‑RGR。所述的载体包含有如序列表SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。本发明专利技术利用RGR方法突变水稻靶基因得到高效转化载体，是一种一元载体，本发明专利技术的编辑载体可用于定向多靶位点突变水稻靶基因，研究水稻中相关基因的功能和作用，也可以用于构建相应的基因突变体和大片段缺失。本发明专利技术的载体具有很高的转化效率和打靶突变效率，可以在水稻中稳定遗传及应用。
【技术实现步骤摘要】
一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种新型的多位点同时定向编辑植物基因组的载体及其制备方法和应用。本专利技术的载体可以对水稻的基因组进行多个位点的同时定向编辑，也可以用于构建相应的基因突变体和大片段缺失，研究水稻中相关基因的功能和作用。
技术介绍
近十年来，植物基因编辑领域的发展突飞猛进，主要依赖于几类核酸酶功能的解析。其中包括锌指核酸酶(zincfingernucleases,ZFNs)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcriptionactivatorlikeeffectornucleases,TALENs)、规律性重复短回文序列簇相关的核酸酶(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatedprotein9,CRISPR/CAS9)。这几类核酸酶均通过特异性的识别靶DNA序列，之后他们会使靶位点引入双链断裂缺口(doublestrandbreak,DSB)来启动细胞內源的两种修复机制：非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)或者同源重组(homologousrecombination,HR)。其中NHEJ主要造成DNA缺口处的碱基插入或者缺失，HR则可以通过外源DNA模板来精确的修复DNA或特异的添加一段DNA。但是ZFNs和TALENs两种基因编辑系统元件组装比较复杂且成本较高，而CRISPR/CAS9系统只需要改变一小段RNA序列即可达到识别不同靶位点的能力，非常经济方便。此外CRISPR/CAS9系统因其操作的便捷性使得该系统可以同时剪切基因组上多个不同的靶位点，这是ZFNs和TALENs很难达到的。因此，CRISPR/CAS9系统已经广泛应用于细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、哺乳动物、拟南芥和水稻等生物体内。此外通过对CAS9蛋白修饰，该系统还能用于转录调控和表观修饰，使得该系统在生物研究领域有着更广泛的前景。但是目前CRISPR/CAS9系统在多位点DNA编辑方面并不是非常的方便，同时该系统中gRNA的表达仅能使用少量小RNA启动子。因此开发多位点DNA编辑的CRISPR/CAS9系统以及拓宽gRNA的启动子将使得基因编辑的应用面更加广。本专利技术为了解决这个问题，采用了一种全新的策略来构建多位点同时定向编辑植物基因组的载体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种植物基因组多位点编辑载体。本专利技术通过定向突变水稻靶基因获得一个能够定向突变水稻多个靶基因的高效转化载体，申请人将该载体命名为pCXUN-CAS9-RGR该载体是基于超量表达载体pCXUN(chenetal.,2009)的基础上构建的。本专利技术构建的多位点编辑载体不仅背景简单，而且将能够高效地将PCR产物连接到载体当中，超量表达载体pCXUN引入的含双XcmI位点的媒介DNA能够经过一次消化即可产生T-载体，将目标DNACas9(miaoetal.,2013)PCR产物克隆其中以构成中间质粒载体pCXUN-CAS9，然后将所述的中间质粒载体pCXUN-CAS9用KpnI&SacI消化后，运用一步快速连接法引入一个启动子序列启动的含目标靶基因序列的RGR(GaoandZhao,2014)，该RGR(Ribozyme-gRNA-Ribozyme)序列由核酶-gRNA-核酶组成,核酶能够自我催化剪切从而释放gRNA，且不受制于传统的U6/U3启动子的限制，而可以扩展到常见的RNA聚合酶Ⅱ型启动子，利用RGR这样的特点，我们将多个RGR串联之后就可以实现快速定向敲除两个靶基因的转化载体pCXUN-Cas9-RGR。本专利技术的重组载体可用于定向突变多个水稻靶基因，研究水稻中相关基因的功能和作用，也可以用于构建相应的基因突变体和大片段缺失，本专利技术的重组载体可以用于发掘新功能基因。本专利技术通过以下技术方案实现：一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR，该载体通过下列步骤制备获得：(1)以SEQIDNO：1所示的序列的起始载体pCXUN为材料，用Xcm1切除该载体中的登陆号为NC_007635.1的ccd基因；(2)在步骤(1)Xcm1切除了载体ccd基因的位置，即744-438碱基位上定向插入SEQIDNO：4所示的CAS9基因片段，得到如SEQIDNO：4所示的中间载体pCXUN-CAS9；(3)将步骤(2)中所得到的中间载体pCXUN-CAS9，用KpnI&SacI消化成线性DNA，引入两个RGR，所述的RGR的引入为下列方式:1)首先选择靶基因特异性序列gRNA，用NEBCutter软件在http://nc2.neb.com/NEBcutter2/网站界面上输入目的基因序列，或者从相关网站上筛选找到23nt的靶序列：N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20NGG，其中N代表任意碱基；2)通过PCR将以下片段中的HammerheadRibozyme即锤头核酶序列置于gRNA的5’端，将所述的D型肝炎病毒核酶序列置于gRNA的3’端(两者核酶的完整序列均来自于质粒pRS316-RGR-GFP(图2)(GaoandZhao,2014),从而得到人工合成的RGR序列单元)，得到人工合成的RGR序列单元：最后以该RGR序列单元为模板(依照Zhang和Gao(2017)在《Bio-protocol》上报道的方法)得到携带靶基因的RGR-基因，将靶位点的两个RGR通过重叠PCR串联在一起形成RGR-基因1+RGR-基因2；其中所述的插入片段中：波浪线的碱基部分为靶基因序列前六个碱基的互补配对序列，长度为1-6bp；斜体碱基部分为HammerheadRibozyme即锤头核酶序列，长度为7-42bp；方框碱基部分为D型肝炎病毒的核酶序列，长度为176-243bp；下划线的碱基部分是设计的基因靶位点序列，长度为43-62bp；GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT是gRNA核心序列，长度为63-175bp；M6M5M4M3M2M1与N1N2N3N4N5N6互补配对；3)选择RiceU6或U3或其他不同类型启动子通过重叠PCR引入在RGR序列单元的5’端，得到启动子-RGR-基因1-RGR-基因2片段；所述的U6启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述的U3启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示；4)用Gibson一步快速连接法将U6或U3-RGR-基因1-RGR-基因2连接到线性化载体pCXUN-CAS9中，得到转化载体pCXUN-Cas9-RGR，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：6所示。本专利技术的一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-Cas9-RGR可在水稻转化中应用。本专利技术的积极效果如下所述：1、本专利技术构建的pCXUN-Cas9-RGR,利用RGR自身催化剪切的特性，可以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN‑CAS9‑RGR，其特征包括，该载体通过下列步骤制备获得：(1)以SEQ ID NO：1所示的序列的起始载体pCXUN为材料，用Xcm1切除该载体中的登陆号为NC_007635.1的ccd基因；(2)在步骤(1)Xcm1切除了载体ccd基因的位置，即744‑438碱基位上定向插入SEQ ID NO：4所示的CAS9基因片段，得到如SEQ ID NO：4所示的中间载体pCXUN‑CAS9；(3)将步骤(2)中所得到的中间载体pCXUN‑CAS9，用KpnI&SacI消化成线性DNA，引入两个RGR，所述的RGR的引入为下列方式:1)首先选择靶基因特异性序列gRNA，用NEB Cutter软件在http://nc2.neb.com/NEBcutter2/网站界面上输入目的基因序列，或者从相关网站上筛选找到23nt的靶序列：N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20NGG，其中N代表任意碱基；2)通过PCR将以下片段中的Hammerhead Ribozyme即锤头核酶序列置于gRNA的5’端，将D型肝炎病毒核酶序列置于gRNA的3’端，得到人工合成的RGR序列单元，具体序列如下所示：...
【技术特征摘要】
1.一种植物基因组多位点编辑载体pCXUN-CAS9-RGR，其特征包括，该载体通过下列步骤制备获得：(1)以SEQIDNO：1所示的序列的起始载体pCXUN为材料，用Xcm1切除该载体中的登陆号为NC_007635.1的ccd基因；(2)在步骤(1)Xcm1切除了载体ccd基因的位置，即744-438碱基位上定向插入SEQIDNO：4所示的CAS9基因片段，得到如SEQIDNO：4所示的中间载体pCXUN-CAS9；(3)将步骤(2)中所得到的中间载体pCXUN-CAS9，用KpnI&SacI消化成线性DNA，引入两个RGR，所述的RGR的引入为下列方式:1)首先选择靶基因特异性序列gRNA，用NEBCutter软件在http://nc2.neb.com/NEBcutter2/网站界面上输入目的基因序列，或者从相关网站上筛选找到23nt的靶序列：N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20NGG，其中N代表任意碱基；2)通过PCR将以下片段中的HammerheadRibozyme即锤头核酶序列置于gRNA的5’端，将D型肝炎病毒核酶序列置于gRNA的3’端，得到人工合成的RGR序列单元，具体序列如下所示：N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGA...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵云德，王荣臣，张涛，和玉兵，杨宁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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