一种高产CpG ISS工程菌构建方法与用途技术

本发明专利技术公开了一种高产CpG ISS工程菌构建方法与应用，其构建方法为：以10条对水产养殖鱼虾类有较佳免疫活性的CpG‑ISS为基础，将10条CpG‑ISS相互串联并人工合成，利用同尾酶切技术将串联序列五次重复克隆于pYES2载体中，构建成多拷贝CpG基序的质粒载体pYES2‑90CpG，并以电转化方式导入酿酒酵母菌株中，获得酵母工程菌，筛选出高产CpG ISS工程菌，即可。有益效果为：本发明专利技术工程菌的构建方法简单可行，构建的工程菌生长繁殖迅速、安全可靠、CpG ISS的产量和生产效率高，能保持CpG‑ISS产品的活性和稳定性，制得的工程菌产物应用于水产动物病害防控方面。

【技术实现步骤摘要】
一种高产CpGISS工程菌构建方法与用途
本专利技术涉及工程菌构建
，尤其涉及一种高产CpGISS工程菌构建方法与用途。
技术介绍
近几年来，我国的畜、禽及水产养殖业得到飞速发展，其总产量均居世界同行业产品之首，不仅满足了国内人民的生活需要，也是出口创汇的主要农产品。但是随着养殖业的快速发展，也出现了一个十分严重的问题，即偏面注重产量提高，却忽视了产品质量，产品的肉质、肉味下降，安全性得不到保证，对国内外市场的广大消费者产生严重的负面影响。分析养殖产品质量下降的原因，主要是养殖对象的种质，环境（用药、水质等）和饲料三大因素。饲料是养殖业的物质基础，饲料添加剂是饲料的核心，“六畜兴旺，饲料为先”。近年来我国安全饲料工业受到国家高度重视，饲料业有了较大发展，但在质量和安全方面还存在不少问题，主要表现在：一是饲料业产业结构不合理，药物饲料添加剂工业严重滞后，抗生素、氨基酸、部分维生素、药物添加剂、色素等不仅品种少，而且质量差和不稳定，毒副作用大。因此，这部分动物防病药物添加剂大多依赖进口；二是饲料安全问题比较突出，在生产领域，少数生产厂家、商贩和养殖户违反饲料法规，在饲料生产和饲养过程中滥用违禁药品，超量、超范围使用兽药，对药物配伍禁忌和停药期间规定执行的不严格；三是真正优质高效无公害的动物防病添加剂稀缺，不能满足市场需要；四是在管理方面，法律、法规和标准体系不够健全，检测手段不完善、监管不力。所以饲料安全问题已成为全社会关注的热点和难点之一。CpG-ISS寡核苷酸免疫激活序列是一种富含未甲基化修饰的胞嘧啶-鸟嘌呤基序的寡聚核苷酸序列。目前，国际上对CpG的免疫生物学功能及其应用研究主要集中在小鼠、大鼠和畜禽等动物以及人类医学，针对水产动物的开发与应用研究还很少。对人、小鼠等动物体内外的大量实验证明，CpG是一种提高机体免疫水平的强有力激活剂。它与目前使用的传统免疫激活类多糖物质等相比，具有活性高、可直接激活单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞（APCs），分泌多种Th1型细胞因子，如干扰素（IFN）、白细胞介素（IL-1、IL-12）等物质，促进机体产生抗原特异性的免疫反应，并能引发强的抗体反应和Th1型体液免疫应答，免疫激活作用强等优势，其作用是传统多糖药物所无法比拟的。特别是CpG-ISS为天然药物，无毒副作用，与目前广泛使用的各种抗生素等相比，无药物残留和产生抗药性等问题，不污染环境，代表了当今药物研制和开发的方向。此外，CpG-ISS是一种免疫激活药物，它能提高机体的整体防病与抗病能力，对各种细菌、病毒等病原微生物具有广谱的抵抗能力，而且在人、畜禽、鱼类、贝类、虾等动物中都具有明显的作用，因此这种药物的使用面广，功效全面，是一种具有重大开发价值的优质药物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构建方法简单可行，构建的工程菌生长繁殖迅速、安全可靠、CpGISS的产量和生产效率高，能保持CpG-ISS产品的活性和稳定性，制得的工程菌产物应用于水产动物病害防控方面的高产CpGISS工程菌构建方法与应用。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种高产CpGISS工程菌构建方法，以10条对水产养殖鱼虾类有较佳免疫活性的CpG-ISS为基础，将10条CpG-ISS相互串联并人工合成，利用同尾酶切技术将串联序列五次重复克隆于pYES2载体中，构建成多拷贝CpG基序（90个拷贝）的质粒载体pYES2-90CpG，并以电转化方式导入酿酒酵母INVSc1菌株中。该工程菌构建方法简单可行，构建的工程菌生长繁殖迅速、不具致病性、不会产生毒素、安全可靠、能保持CpG-ISS产品的活性和稳定性，有效解决了CpGISS生产成本高、生产效率低的问题。构建方法的具体步骤为：步骤1：以在人、小鼠、鱼等不同动物中具有免疫激活效应的25条CpGISS为模板，以巨噬细胞呼吸爆发、吞噬杀菌、溶菌酶、酚氧化酶和血清杀菌活性等为指标，检测其在水产动物中的免疫激活效应，最终筛选出10条水产养殖动物最适CpGISS，备用；步骤2：将步骤1中筛选得到的10条碱基序列依次串联起来，并在3’末端引入XhoI酶切位点形成含18CpG基序的DNA片段，然后与退火缓冲液及无菌水混合，于88-92℃热水浴中孵育4-6min，孵育结束后自然冷却至室温，然后将DNA片段定向克隆于pMD18-T载体中，克隆后的质粒称pMD18-T/18CpG；步骤3：利用同尾酶XhoI和SalI对步骤2所得的重组质粒pMD18-T/18CpG进行双酶切，获得两端具有相同黏性末端的CpG片段，并将该CpG片段重组入经XhoI酶切的pYES2载体中，构建含18CpG串联子序列的pYES2-18CpG中间质粒，继续利用XhoI和SalI同尾酶技术，将含18CpG的串联序列在pYES2载体中五次重复，构建出含90个CpG基序的串联序列质粒载体pYES2-90CpG，将质粒载体pYES2-90CpG电转化到E.coliTop10中，并用Amp抗性筛选转化子，转化子扩增后，提取可转化的质粒，用菌落PCR、HindШ/XbaI酶切和电泳鉴定克隆子，并对pYES2-90CpG进行测序，该步骤中pYES2大小为5857bp，其中包含氨苄青霉素抗性基因、GAL1启动子控制下供外源基因插入的多克隆位点，以及URA3基因，稳定性和安全性高，不会向自然界中不含有该类基因的微生物转移，插入的外源序列为含有90个CpG基序的多拷贝序列，外源基因通过同尾酶SalI/XhoI插在pYES2质粒的XhoI酶切位点上，无删除片段，对质粒扩增、筛选和外源基因的表达无影响，获得的pYES2-90CpG质粒对水产养殖动物（鱼、虾、鳖、贝等）具有显著激活作用，并且具有广谱的适用性和实用性；步骤4：将pYES2-90CpG质粒电转化导入酿酒酵母INVSc1菌株中，获得酵母工程菌，筛选出高产CpGISS工程菌，即可，90CpG重组子具有与出发株相同的形态，相同的繁殖过程，因此该工程菌保留了相同的生物学特性，成功表达出重组CpGISS，表达量高、产量高，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，连续传代10次，经PCR检测目的基因仍遗传稳定，经SDS检测外源基因仍能稳定表达。作为优选，高产CpGISS工程菌的筛选方法为：a菌种活化：将菌种接种于斜面培养基，25-30℃培养箱培养5-7d后接入种子培养基，放置于25-30℃摇床、230-250rpm条件下培养2-4d作为种子培养液，同时进行无染菌检测和显微镜菌丝形态观察，测定pH值，接种于发酵培养基25-30℃摇床培养6-7d放瓶；b自然分离：选择稳定高产的菌种，取菌种生长5-7d新鲜斜面，用接种铲刮下孢子，移入含无菌去离子水及玻璃珠的灭菌试管中，放于涡旋振荡器上振荡，使孢子充分散开，后进行稀释涂布固体培养基、生长为单菌落后观察其形态，采用原工艺，在相同条件下培养发酵以筛选出CpGISS高产菌株；c传代稳定性：对CpGISS高产菌株的母代、子一代(F1)、子二代(F2)、子三代(F3)、子四代(F4)、子五代(F5)稳定性进行考察，考察方法：将新鲜培养好的母代接F1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产CpG ISS工程菌构建方法，其特征在于：所述构建方法以CpG‑ISS为基础，相互串联并人工合成，利用同尾酶切技术将串联序列克隆于pYES2载体中，构建成多拷贝CpG基序的质粒载体pYES2‑90CpG，并以电转化方式导入酿酒酵母INVSc1菌株中。

【技术特征摘要】
1.一种高产CpGISS工程菌构建方法，其特征在于：所述构建方法以CpG-ISS为基础，相互串联并人工合成，利用同尾酶切技术将串联序列克隆于pYES2载体中，构建成多拷贝CpG基序的质粒载体pYES2-90CpG，并以电转化方式导入酿酒酵母INVSc1菌株中。2.根据权利要求1所述的一种高产CpGISS工程菌构建方法，其特征在于：所述构建方法的具体步骤为：步骤1：以CpGISS为模板，检测其在水产动物中的免疫激活效应，筛选出最适CpGISS，备用；步骤2：将步骤1中筛选得到的10条碱基序列依次串联起来，并形成含18CpG基序的DNA片段，孵育后冷却至室温，克隆于pMD18-T载体中得pMD18-T/18CpG；步骤3：利用同尾酶XhoI和SalI对步骤2所得的重组质粒pMD18-T/18CpG重组入pYES2载体中，构建pYES2-18CpG中间质粒，将18CpG序列在pYES2载体中五次重复，构建出质粒载体pYES2-90CpG；步骤4：将pYES2-90CpG质粒电转化导入酿酒酵母INVSc1菌株中，获得酵母工程菌，筛选出高产CpGISS工程菌，即可，所述筛选用发酵培养基中含有天门冬氨酸。3.根据权利要求2所述的一种高产CpGISS工程菌构建方法，其特征在于：所述所述步骤3中质粒载体pYES2-90CpG的鉴定方法包括：将质粒载体pYES2-90CpG电转化到E.coliTop10中，并用Amp抗性筛选转化子；转化子扩增后，提取可转化的质粒，用菌落PCR、HindШ/XbaI酶切和电泳鉴定克隆子，并对pYES2-90CpG进行测序。4.根据权利要求2所述的一种高产CpGISS工程菌构建方法，其特征在于：所述步骤4中高产CpGISS工程菌的筛选方法为：a菌种活化：将菌种接种于斜面培养基培养，然后接入种子培养基，培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡向东，项黎新，叶茂，
申请(专利权)人：浙江皇冠科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33