一种通过对核酸酶系统敲除以调控体外生物合成活性的方法技术方案

本发明专利技术提供了一种通过对核酸酶系统敲除以调控体外生物合成活性的方法，具体地，从很多种核酸酶中筛出5种核酸酶，其中对其中一种核酸酶（如EXN53）进行下调或敲除处理，发现可以提高核酸的稳定性，并显著提高体外蛋白质合成体系产生蛋白质的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种通过对核酸酶系统敲除以调控体外生物合成活性的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种通过对核酸酶系统敲除以调控体外生物合成活性的方法。
技术介绍
蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白的序列和结构不同，决定了其功能的不同。在细胞内，蛋白可以作为酶类催化各种生化反应，可以作为信号分子协调生物体的各种活动，可以支持生物形态，储存能量，运输分子，并使生物体运动。在生物医学领域，蛋白质抗体作为靶向药物，是治疗癌症等疾病的重要手段[1-2]。在细胞中，蛋白质翻译的调节在应对营养缺失等外界压力，细胞发育与分化等很多过程中发挥重要作用。蛋白质翻译的四个过程包括翻译起始、翻译延伸、翻译终止和核糖体再循环，其中翻译起始是受调控最多的一个过程[3]。在翻译起始阶段，核糖体小亚基（40S）结合(tRNA)iMet，并在翻译起始因子的作用下识别mRNA5’末端。小亚基向下游移动，并在起始密码子（ATG）位置与核糖体大亚基（60S）结合，形成完整核糖体，并进入翻译延伸阶段[4]。体外生物合成系统(invitrobiosynthesissystem)是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，通过加入外源编码的核酸DNA、RNA、底物和能量源，完成特定化学分子或生物大分子（DNA,RNA,蛋白质）的体外高效合成。常见的体外生物合成系统是体外蛋白质合成系统(invitroproteinsynthesissystem)，通过外源mRNA或者DNA模板、利用细胞裂解物，完成外源重组蛋白的快速高效翻译[5]。商业上常见的体外蛋白质合成系统是体外转录-翻译偶联的体系(invitrotranscription-translationsystem，简称IVTT)，通过DNA模板、经RNA聚合酶转录出mRNA中间体，再利用氨基酸和ATP等组分，完成外源蛋白的一步高效翻译。目前，常见的商业化体外蛋白表达系统包括大肠杆菌系统（Escherichiacoliextract，ECE）、兔网织红细胞（RabbitreticuLocytelysate，RRL）、麦胚（Wheatgermextract,WGE）、昆虫（Insectcellextract,ICE）和人源系统。核酸mRNA和DNA蛋白质体外合成系统中的编码底物，它们的稳定性影响着蛋白质的得率。核酸酶是在核酸分解的第一步中，水解核苷酸之间的磷酸二酯键的一种蛋白质。有些核酸酶只能作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNase）。根据核酸酶作用的位置不同，又可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。细胞内绝大多数RNA的降解主要通过定位于细胞质的5′to3′核酸外切酶和定位于细胞核的5′to3′核酸外切酶，或者通过定位于细胞质和细胞核的，具有3′to5′核酸外切酶和核酸内切酶活性的蛋白亚基复合体exosome的作用而降解。CRISPR/Cas(ClusteredReguLatoryInterspacedShortPalindromicRepeats/CRISPRassociated)是广泛存在于细菌和古细菌中的一种生物防御系统。其中经过改造的Ⅱ型系统，CRISPR/Cas9，成为现在广泛使用的基因组改造工具。在guideRNA(gRNA)的介导下，Cas9蛋白识别基因组上protospaceradjacentmotif(PAM)及其上游20bp序列，并在PAM上游3bp位置产生双链切口。在同时提供供体DNA（donorDNA)的情况下，被CRISPR/Cas9双链切开的基因可以HDR的方式重组入新的序列，以达到基因改造的目的。在酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因组改造的实例很多，包括基因点突变、基因敲除和基因插入。目前的体外合成系统中可能留存一些核酸酶，这些核酸酶会通过降解体外合成系统中的mRNA和DNA，从而影响体外合成系统中核酸的稳定性。因此，本领域迫切需要开放一种通过稳定核酸实现外源蛋白稳定表达的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过稳定核酸实现外源蛋白稳定表达的方法。本专利技术第一方面提供了一种体外的无细胞的蛋白合成体系，所述无细胞的蛋白合成体系包括：(a)酵母细胞提取物；(b)聚乙二醇；(c)任选的外源蔗糖；和(d)任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂，其中，所述酵母细胞提取物中的EXN53蛋白的含量≤10%，较佳地，≤5%，更佳地，≤2％。在另一优选例中，所述酵母细胞提取物中的EXN53的含量为0。在另一优选例中，所述EXN53来源于选自下组的一种或多种来源的酵母：毕氏酵母、克鲁维酵母，较佳地，来源于克鲁维酵母。在另一优选例中，所述克鲁维酵母包括马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母。在另一优选例中，所述EXN53的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述EXN53的蛋白序列如SEQIDNO.:6所示。在另一优选例中，所述无细胞的蛋白合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：(e1)用于合成RNA的底物；(e2)用于合成蛋白的底物；(e3)镁离子；(e4)钾离子；(e5)缓冲剂；(e6)RNA聚合酶；(e7)能量再生系统。在另一优选例中，所述无细胞的蛋白合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：(e8)血红素；(e9)亚精胺。在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组的一种或多种来源的酵母：毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为马克斯克鲁维酵母、和/或乳酸克鲁维酵母。在另一优选例中，所述的酵母细胞提取物为对酵母细胞的水性提取物。在另一优选例中，所述酵母细胞提取物不含酵母内源性的长链核酸分子。在另一优选例中，所述的酵母细胞提取物是用包括以下步骤的方法制备：（i）提供酵母细胞；（ii）对酵母细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的酵母细胞；（iii）对经洗涤的酵母细胞进行破细胞处理，从而获得酵母粗提物；和（iv）对所述酵母粗提物进行固液分离，获得液体部分，即为酵母细胞提取物。在另一优选例中，所述的固液分离包括离心。在另一优选例中，在液态下进行离心。在另一优选例中，所述离心条件为5000-100000×g，较佳地，8000-30000×g。在另一优选例中，所述离心时间为0.5－2h，较佳地，20min－50min。在另一优选例中，所述离心在1-10℃下进行，较佳地，在2-6℃下进行。在另一优选例中，所述的洗涤处理采用洗涤液在pH为7-8（较佳地，7.4）下进行处理。在另一优选例中，所述洗涤液选自下组：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾、醋酸钾、醋酸镁、或其组合。在另一优选例中，所述的破细胞处理包括高压破碎、冻融（如液氮低温）破碎。在另一优选例中，所述的合成RNA的底物包括：核苷单磷酸、核苷三磷酸、或其组合。在另一优选例中，所述的合成蛋白的底物包括：1-20种天然氨基酸、以及非天然氨基酸。在另一优选例中，所述镁离子来源于镁离子源，所述镁离子源选自下组：醋酸镁、谷氨酸镁、或其组合。在另一优选例中，所述钾离子来源于钾离子源，所述钾离子源选自下组：醋酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外的无细胞的蛋白合成体系，其特征在于，所述无细胞的蛋白合成体系包括：(a) 酵母细胞提取物；(b) 聚乙二醇；(c) 任选的外源蔗糖；和(d) 任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂，其中，所述酵母细胞提取物中的EXN53蛋白的含量≤10%，较佳地，≤5%，更佳地，≤2％。

【技术特征摘要】
1.一种体外的无细胞的蛋白合成体系，其特征在于，所述无细胞的蛋白合成体系包括：(a)酵母细胞提取物；(b)聚乙二醇；(c)任选的外源蔗糖；和(d)任选的溶剂，所述溶剂为水或水性溶剂，其中，所述酵母细胞提取物中的EXN53蛋白的含量≤10%，较佳地，≤5%，更佳地，≤2％。2.如权利要求1所述的蛋白合成体系，其特征在于，所述EXN53来源于选自下组的一种或多种来源的酵母：毕氏酵母、克鲁维酵母，较佳地，来源于克鲁维酵母。3.如权利要求1所述的蛋白合成体系，其特征在于，所述EXN53的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。4.如权利要求1所述的蛋白合成体系，其特征在于，所述EXN53的蛋白序列如SEQIDNO.:6所示。5.一种酵母细胞提取物，其特征在于，所述酵母细胞提取物中的EXN53蛋白的含量≤10%，较佳地，≤5%，更佳地，≤2％。6.一种权利要求1所述的体外的无细胞的蛋白合成体系的生产方法，其特征在于，包括步骤：将(a)酵母细胞提取物与(b)聚乙二醇；(c)任选的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭敏，薛银鸽，代田纯，姜灵轩，郑竹霞，柴智，刘帅龙，于雪，
申请(专利权)人：康码上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31