一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，本发明专利技术的发明专利技术人偶然发现将大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力，由此发明专利技术了提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，解决了目前黑曲霉的发酵生产纤维素酶方面的技术难题。

【技术实现步骤摘要】
一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒，属于生物工程

技术介绍
黑曲霉是曲霉属真菌中的一个常见菌种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，也是重要的发酵工业菌种，可用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等，是制酱、酿酒和制醋的主要菌种。黑曲霉是目前食品工业领域应用广泛的菌种，如何提高黑曲霉的纤维素酶产量和酶活力也是本领域的研究人员一直致力于解决的技术难题。例如，通过基因工程的手段导入纤维素外切酶基因，提高外切酶的酶活力，或者敲除一些外分泌蛋白，降低外分泌蛋白的分泌量，从而提高纤维素酶蛋白的分泌量。除了黑曲霉以外，黄单胞菌属中不少菌种的基因组中也含有胞外纤维素酶基因，例如，在野油菜黄单胞菌(X.campestrispv.campestris，简称Xcc)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是engXCA；在白叶枯病菌(X.oryzaepv.oryzae，简称Xoo)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是clsA(与engXCA基因同源)、eglXoB和cbsA；在柑橘溃疡病菌(X.axonopodispv.citri29-1，简称Xac)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是bglC3；在大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines，简称Xag)中，其含有的胞外纤维素酶基因主要是engXCA基因。然而，上述这些黄单胞菌属菌株的胞外纤维素酶基因是否可以加以利用来提高黑曲霉的纤维素酶的酶活力，本领域技术人员尚未进行这方面的研究。
技术实现思路
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本专利技术一方面提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的engXCA基因；步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。优选的，所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQIDNo.1所示。优选的，所述步骤1)中，clp基因启动子序列如SEQIDNo.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQIDNo.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQIDNo.6所示。优选的，在所述步骤2)中，所采用的表达载体为pCAMBIA1300载体。优选的，在所述步骤2)中，所采用的限制性内切酶为SmaI和XbaI。优选的，所述步骤3)中是通过PEG介导的原生质体转化将所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中。优选的，所述步骤3)中，将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲酶CICC41061菌株中，获得重组黑曲霉菌株。本专利技术另一方面提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的试剂盒，其中，所述试剂盒至少包含纤维素酶的表达载体，所述纤维素酶的表达载体含有纤维素酶表达单元，所述纤维素酶表达单元为clp基因启动子序列-clp基因的完整ORF序列-engXCA基因启动子序列-engXCA基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的engXCA基因。优选的，所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQIDNo.1所示。优选的，所述clp基因启动子序列如SEQIDNo.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQIDNo.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQIDNo.6所示。本专利技术另一方面提供了一种重组黑曲霉菌株，其中，所述重组黑曲霉菌株是采用如上述的方法获得的重组黑曲霉菌株。本专利技术的专利技术人偶然发现将大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力，由此获得了本专利技术的一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法及其试剂盒。附图说明图1为对比实验中的实施组1和2以及对比组1和2的菌株分泌的胞外纤维素滤液的水解透明圈半径的数据结果。具体实施方式本专利技术的专利技术人在研究的过程中，偶然发现，将大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines，简称Xag)的纤维素酶基因通过重组表达载体转入黑曲霉菌中，可以显著提高黑曲霉菌株的纤维素酶活力。在本专利技术的一个具体实施方案中，提供了一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，该方法包括以下步骤：步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的engXCA基因；步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。关于术语“clp基因”，编码clp(Crp-likeprotein)，又称为全局性调控转录子基因，其表达的蛋白(也称全局性调控子蛋白)通过与启动子区保守的DNA绑定位点结合，从而调控其下游基因(约占全基因组20％的基因)的转录表达。在本申请中，clp基因是指大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的clp基因。术语“ORF序列”是指开放性阅读框(openreadingframe)，是指结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框，可以编码完整的多肽链，中间不存在使翻译中断的终止密码子。术语“engXCA基因”是指胞外纤维素酶的编码基因。在本专利技术中具体指大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines，简称Xag)中的engXCA基因。clp基因表达后的Clp蛋白可以与engXCA基因的启动子序列结合，从而调控纤维素酶的表达。在本专利技术的一个优选实施方案中，发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodis pv.glycines)的engXCA基因；步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。

【技术特征摘要】
1.一种提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：步骤1)构建clp基因序列和engXCA基因序列：所述clp基因序列包含clp基因启动子序列和clp基因的完整ORF序列；所述clp基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的clp基因；所述engXCA基因序列包含engXCA基因启动子序列和engXCA基因的完整ORF序列；所述engXCA基因是大豆斑疹病菌(X.axonopodispv.glycines)的engXCA基因；步骤2)构建纤维素酶的表达载体：将所述步骤1)构建的所述clp基因序列和所述engXCA基因序列通过限制性内切酶、DNA连接酶作用，构建到表达载体上获得所述纤维素酶的表达载体；步骤3)将所述步骤2)构建获得的所述纤维素酶的表达载体转化到黑曲霉中，获得重组黑曲霉菌株。2.如权利要求1所述的提高黑曲霉的纤维素酶的酶活的方法，其特征在于：所述engXCA基因启动子序列中的第-148～-163位点的序列为5'-TGTGACCGGTGTCACA-3'，如SEQIDNo.1所示。3.如权利要求1所述的提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：在所述步骤1)中，clp基因启动子序列如SEQIDNo.2所示，clp基因的完整ORF序列如SEQIDNo.3所示，engXCA基因启动子序列如SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示，engXCA基因的完整ORF序列如SEQIDNo.6所示。4.如权利要求1至3中任意一项所述的提高黑曲霉的纤维素酶活力的方法，其特征在于：在所述步骤2)中，所采用的表达载体为pCAMBI...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭威，夏彦飞，方洁，赵丽娜，高思涵，卢娉婷，苏如意，
申请(专利权)人：浙江师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33