农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法技术

技术编号:19712153 阅读:34 留言:0更新日期:2018-12-08 18:16
本发明专利技术涉及小麦矮腥黑粉菌的遗传转化,具体涉及农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法。包括:培养TCK冬孢子,当萌发率≥60%时收集菌丝,配制1×10

【技术实现步骤摘要】
农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法
本专利技术涉及小麦矮腥黑粉菌的遗传转化,具体涉及农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法。
技术介绍
小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn,TCK)引起的小麦矮腥黑穗病是世界上最具破坏性的小麦病害之一,矮腥黑粉菌通过产生有毒的黑色真菌冬孢子释放鱼腥味的三甲胺,致使小麦减产和品质降低,给小麦生产造成毁灭性的危害。因此,对小麦矮腥黑穗病的防治刻不容缓。有关小麦矮腥黑粉菌的致病基因及致病分子机理尚不清楚,而构建大容量的小麦矮腥黑粉菌转化子库是研究该病菌功能基因及小麦和矮腥黑粉菌互作的基础。在众多真菌遗传转化方法中,农杆菌介导的转化技术(Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation,ATMT)不仅具有操作简便、转化效率高、受体不受限制等优点,而且转化子稳定性好、T-DNA在真菌基因组中多为单拷贝插入。自从1973年Mishra等首次报道真菌遗传转化以来,该技术已在多种真菌的遗传转化中得到广泛应用。1983年,Banks等利用PEG-CaCl2介导含有氨基糖苷类抗生物素基因质粒转化到玉米黑粉菌的原生质中是黑粉菌转基因研究的开始,之后又有学者利用潮霉素和PEG-CaCl2方法转化质粒,通过同源或非同源重组的方式整合到玉米黑粉菌基因组中;张新明不仅建立了大麦坚黑粉菌的遗传转化体系并对转化相关因子做了优化,并且还比较了电击法、PEG-CaCl2和农杆菌介导法(ATMT)对大麦坚黑粉菌的转化效率,证明了ATMT法明显优于其他两种方法。目前,对于小麦矮腥黑粉菌的研究多集中在形态鉴定和分类,关于根癌农杆菌介导小麦矮腥黑粉菌的遗传转化体系还未建立。鉴于此,利用ATMT方法对小麦矮腥黑粉菌进行遗传转化研究,建立低成本、快速、高效的小麦矮腥黑粉菌转化体系,将为小麦矮腥黑粉菌突变体库的构建、致病分子机制的研究、致病相关基因克隆及功能研究奠定基础。
技术实现思路
为了促进小麦矮腥黑粉菌致病分子机制的研究,本专利技术提供一种小麦矮腥黑粉菌的农杆菌转化方法,该方法能够将外源基因成功转入小麦矮腥黑粉菌基因组中并稳定遗传。本专利技术请求保护的技术方案如下:农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)菌丝液制备:培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子,当冬孢子萌发率≥60%时收集菌丝,离心去上清液,然后用灭菌水配制浓度为1×106个/ml的菌丝液;(2)农杆菌菌液制备:将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中,28℃振荡培养2-3d,用IM培养基稀释菌液至OD600为0.15-0.35,继续振荡培养7-8h,然后用IM培养基稀释菌液至OD600为0.53-0.59;(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸,将OD600为0.53-0.59的农杆菌菌液与1×106个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上,置于20-22℃黑暗培养48h;然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上,使涂布有菌液的一面贴合培养基,5℃黑暗培养至菌落长出。优选地,所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。优选地,培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的步骤如下:配制浓度为1×106个/mL的冬孢子悬浮液,取冬孢子悬浮液涂布于土壤浸提液培养基上,置于温度为5℃、相对湿度为50%的人工气候生长培养箱中进行全光照培养。优选地,所述土壤浸提液培养基的配方为:称取75g已灭菌的土壤,溶于500ml沸水中,经纱布过滤后取滤液,加入16~18g琼脂,用蒸馏水定容至1L。优选地,所述CM固体培养基的配方为:酵母膏1g,酶水解干酪素0.5g,酸水解干酪素0.5g,葡萄糖10g,Ca(NO3)2·4H2O1g,KH2PO40.2g,MgSO4·7H2O0.25g,NaCl0.15g,琼脂18g,加蒸馏水至1000mL。优选地,所述IM培养基的配方为:K-buffer0.8mL,M-Nbuffer20mL,1%CaCl2·2H2O(w/v)1mL,20%葡萄糖(w/v)10mL,20%NH4NO3(w/v)2.5mL,50%甘油(v/v)10mL,补蒸馏水至1000mL;所述K-buffer的配方为:200g/LK2HPO4,145g/LKH2PO4;所述M-Nbuffer的配方为:30g/LMgSO4·7H2O,15g/LNaCl。优选地,所述IM培养基在使用之前,每毫升IM培养基加入4μL0.2mol/L乙酰丁香酮,1μL0.01%FeSO4(w/v),10μL100mg/mL2-(N-吗啡啉)乙磺酸。优选地,其特征在于,所述表达载体为pDHT-sk。优选地,所述LB液体培养基含有100μg/mL的利福平和50μg/mL的卡那霉素。优选地,所述CM固体培养基含有100μg/mL的潮霉素B和200μg/mL的头孢噻肟钠。小麦矮腥黑粉菌的萌发和生长缓慢,其冬孢子萌发需要在低温下进行,10℃以上的萌发温度常常产生畸形菌丝,很少形成小孢子,并出现自溶现象。小麦矮腥黑粉菌独特的生物学特征导致农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化十分困难。影响小麦矮腥黑粉菌转化的因素很多,冬孢子萌发菌丝的活力和浓度、农杆菌的活力和浓度、菌丝和农杆菌的配比、IM培养基组成、CM培养基组成、共培养温度对农杆菌介导的TCK转化均有很大的影响,任何条件的改变都可能导致转化失败。专利技术人经过长期研究,首次建立了农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化体系,利用根癌农杆菌菌株EHA105成功转化了小麦矮腥黑粉菌,并获得了50个/106的转化率,为研究小麦矮腥黑粉菌致病分子机制奠定了基础。附图说明图1.小麦矮腥黑粉菌转化子转接第二代长出的菌落;其中,A1,A2为OD600=0.530的农杆菌菌液转化TCK所得;B1,B2为OD600=0.560的农杆菌菌液转化TCK所得;C1,C2为OD600=0.591的农杆菌菌液转化TCK所得。图2.转化子鉴定结果;其中,泳道1:含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物;泳道2-5:TCK转化子菌落PCR产物;泳道6:以ddH2O为模板的PCR产物。图3.转化子的假阳性鉴定结果;其中,泳道1:含有质粒pDHt-SK的农杆菌EHA105的菌液PCR产物;泳道2-5:TCK转化子菌落PCR产物;泳道6:以ddH2O为模板的PCR产物。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明,需要理解的是,下述实施例仅作为解释和说明,不以任何方式限制本专利技术的保护范围。生物材料小麦矮腥黑粉菌(TilletiacontroversaKühn,TCK):本专利技术所使用的小麦矮腥黑粉菌菌株为现有文献L.GAOetal.DevelopmentofaSCARMakerbyinter-simplesequencerepeatfordignoisisofDwarfBuntofWheatandDetectionofTilletiacontroversaKuhn.FoliaMicrobiol.55(3),258–264(2010)所记载,参见其中材料与方法部分记载的在美国由B.Goates教授分离到的分离株。本专利技术所使用的农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。上述生物材料,本实验室亦有保存,申请人声明可自申请日起二十年内向公众本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)菌丝液制备:培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子,当冬孢子萌发率≥60%时收集菌丝,离心去上清液,然后用灭菌水配制浓度为1×106个/ml的菌丝液;(2)农杆菌菌液制备:将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中,28℃振荡培养2‑3d,用IM培养基稀释菌液至OD600为0.15‑0.35,继续振荡培养7‑8h,然后用IM培养基稀释菌液至OD600为0.53‑0.59;(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸,将OD600为0.53‑0.59的农杆菌菌液与1×106个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上,置于20‑22℃黑暗培养48h;然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上,使涂布有菌液的一面贴合培养基,5℃黑暗培养至菌落长出。

【技术特征摘要】
1.农杆菌介导的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)菌丝液制备:培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子,当冬孢子萌发率≥60%时收集菌丝,离心去上清液,然后用灭菌水配制浓度为1×106个/ml的菌丝液;(2)农杆菌菌液制备:将含有表达载体的农杆菌接种于LB液体培养基中,28℃振荡培养2-3d,用IM培养基稀释菌液至OD600为0.15-0.35,继续振荡培养7-8h,然后用IM培养基稀释菌液至OD600为0.53-0.59;(3)在CM固体培养基上铺一层无菌玻璃纸,将OD600为0.53-0.59的农杆菌菌液与1×106个/ml的菌丝液等体积混合后涂布于玻璃纸上,置于20-22℃黑暗培养48h;然后将玻璃纸转移至新的CM固体培养基上,使涂布有菌液的一面贴合培养基,5℃黑暗培养至菌落长出。2.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,所述农杆菌为根癌农杆菌菌株EHA105。3.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,培养小麦矮腥黑粉菌冬孢子的步骤如下:配制浓度为1×106个/mL的冬孢子悬浮液,取冬孢子悬浮液涂布于土壤浸提液培养基上,置于温度为5℃、相对湿度为50%的人工气候生长培养箱中进行全光照培养。4.根据权利要求3所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,所述土壤浸提液培养基的配方为:称取75g已灭菌的土壤,溶于500ml沸水中,经纱布过滤后取滤液,加入16~18g琼脂,用蒸馏水定容至1L。5.根据权利要求1所述的小麦矮腥黑粉菌转化方法,其特征在于,所...

【专利技术属性】
技术研发人员:高利陈万权刘俭俭秦丹丹陈德来周磊邵文达刘太国刘博
申请(专利权)人:中国农业科学院植物保护研究所
类型:发明
国别省市:北京,11

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