提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet‑1，载体pCDFDuet‑1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp‑2蛋白基因scp2，Scp‑2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp‑2蛋白基因scp2的表达。本发明专利技术开还公开了该质粒pCDSP的制备和使用方法。本发明专利技术提供的质粒pCDSP为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的方法与工具。

【技术实现步骤摘要】
提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP及其制备和使用方法
本专利技术属于生物基因工程领域，特别是涉及一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，还涉及一种该质粒pCDSP的制备方法，还涉及一种该质粒pCDSP的使用方法。
技术介绍
角鲨烯是一种天然存在于多种微生物及动植物细胞内的三萜烯类化合物，具有抗氧化，保护心脏，提高免疫力，降低血脂及抑制癌症发展等多种功效，已被广泛应用于医药及保健品领域。当前，市面上的角鲨烯主要来源于植物种子及动物肝脏的提取，因此价格比较昂贵，另外通过提取的方法获得还具有周期长、成本高、破坏环境等缺点，因此，亟需新的更环保、更廉价的生产方式。微生物发酵生产活性化合物具有廉价、快速、环保等优点。近年来，诸多研究致力于利用酵母、微藻及沼泽红假单胞菌等微生物进行角鲨烯的发酵生产，但均未实现突破，其产量与工业化生产要求尚有较大差距。究其原因，角鲨烯含量低或发酵密度低等因素限制了角鲨烯的最终产量。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，用于提高大肠杆菌中角鲨烯的合成。本专利技术的第二个目的是提供一种上述质粒pCDSP的制备方法，用于制备该质粒pCDSP。本专利技术的第三个目的是提供一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，用以实现如何使用该质粒pCDSP促使大肠杆菌大量合成角鲨烯。为了达到上述第一个目的，本专利技术所采用的第一种技术方案是，一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDFori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。为了达到上述第二个目的，本专利技术所采用的第二个技术方案是，一种质粒pCDSP的制备方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP；步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证。本专利技术的第二种技术方案，还具有以下特点：在所述步骤1中，Scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和EcoRI(GAATTC)酶切位点。在所述步骤2中，先采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因片段插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，最后利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pCDSP。为了达到上述第三个目的，本专利技术所采用的技术方案是，一种利用质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，先将野生菌株E.coliC43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得能够合成角鲨烯的重组菌E.coliCSQ1，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列4所示；步骤2，热击法转化质粒pCDSP，利用链霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coliCSSP1；步骤3，分析重组菌E.coliCSSP1中角鲨烯的含量。本专利技术的第三种技术方案，还具有以下特点：所述步骤3具体为：先将采用LB液体培养基培养E.coliCSSP1，并加入诱导剂IPTG诱导Scp-2蛋白基因scp2表达；之后通过皂化法分离、提取合成的角鲨烯；最后通过高效液相色谱法检测该角鲨烯的含量。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术提供的用于提高大肠杆菌中角鲨烯的含量的方法，通过表达Scp-2蛋白促使角鲨烯从内膜上萃取以增加角鲨烯的储存空间，最终提高了角鲨烯的积累量；(2)本专利技术提供的质粒pCDSP用于表达Scp-2蛋白以萃取角鲨烯，含有链霉素抗性基因作为筛选标记，以强启动子PT7通过控制Scp-2蛋白基因scp2的表达来提高Scp-2蛋白的表达量；(3)本专利技术提供的质粒pCDSP为大肠杆菌发酵生产角鲨烯提供了有效的方法与工具。附图说明图1是本专利技术所涉及的质粒pCDSP的构建原理图；图2是本专利技术所涉及的质粒pCDSP中Scp-2蛋白基因scp2双酶切回收凝胶电泳图；图3是本专利技术所涉及的质粒pCDSP及其验证示意图；图4是本专利技术所涉及的质粒pCDSP的菌落PCR验证图；图5是本专利技术所涉及的质粒pCDSP的双酶切验证凝胶电泳图；图6是本专利技术所涉及的标准品、重组菌E.coliCSQ1以及重组菌E.coliCSSP1合成的角鲨烯的验证高效液相色谱图。具体实施方式以下结合附图说明和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步地详细说明。实施例1一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDFori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。实施例2一种上述质粒pCDSP的制备方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP，具体为：先采用NcoI与EcoRI两种限制性内切酶对质粒pUCSP与载体pCDFDuet-1分别进行双酶切，然后通过凝胶电泳回收从质粒pUCSP中切下的Scp-2蛋白基因scp2片段与线性化的载体pCDFDuet-1，之后再通过连接反应将Scp-2蛋白基因插入线性化的载体pCDFDuet-1并转入大肠杆菌DH5α中，利用氨苄青霉素抗性筛选得到质粒pCDSP；步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证。实施例3一种利用上述质粒pCDSP提高大肠杆菌中角鲨烯含量的方法，具体按照以下步骤实施：步骤1，先将野生菌株E.coliC43(DE3)制备成氯化钙感受态细胞，然后通过热击法转化质粒pTsqs，最后利用氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.coliCSQ1，质粒pTsqs的核苷酸序列如序列3所示；步骤2，热击法转化质粒pCDSP，利用链霉素抗性筛选和菌落PCR验证获得重组菌E.co本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，其特征在于，包括载体pCDFDuet‑1，载体pCDFDuet‑1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDF ori、链霉素抗性基因和Scp‑2蛋白基因scp2，Scp‑2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp‑2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp‑2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。

【技术特征摘要】
1.一种提升大肠杆菌中角鲨烯含量用质粒pCDSP，其特征在于，包括载体pCDFDuet-1，载体pCDFDuet-1内插入有阻碍蛋白表达基因lacI、大肠杆菌复制起始位点CDFori、链霉素抗性基因和Scp-2蛋白基因scp2，Scp-2蛋白基因scp2上游具有PT7启动子以启动Scp-2蛋白基因scp2的表达，质粒pCDSP的核苷酸序列如序列1所示，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示。2.一种权利要求1所述质粒pCDSP的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1，依据大鼠Scp-2蛋白的氨基酸序列，并根据大肠杆菌密码子偏好性设计出适合大肠杆菌表达的Scp-2蛋白基因scp2，之后将Scp-2蛋白基因scp2插入载体pUC57中得到质粒pUCSP，Scp-2蛋白基因scp2的核苷酸序列如序列2所示；步骤2，质粒pUCSP中的Scp-2蛋白基因scp2通过酶切和连接反应插入载体pCDFDuet-1中，形成质粒pCDSP；步骤3，利用菌落PCR与双酶切方法对质粒pCDSP进行验证。3.根据权利要求2所述的质粒pUCSP的制备方法，其特征在于，在所述步骤1中，Scp-2蛋白基因scp2的两端分别添加有NcoI(CCATGG)酶切位点和EcoRI(GAATTC)酶切位点。4.根据权利要求3所述的质粒pCDSP的制备方法，其特征在于，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文，姚佳，李薇，马茜，孙晓敬，汪洋，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西,61