一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用，该TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，组装的环状5联体由62个单体经酶切‑连接反应形成。本发明专利技术的TALE表达载体为可在一天内快速装配定制型TALE载体，消除现有技术中TALE应用的障碍，可以激活外源报告基因和内源基因的表达。本发明专利技术TALE表达快速构建TALE载体的方法，制备62个新单体用这些单体可在一天内快速装配定制型TALE载体，本发明专利技术通过设计和装配针对转录因子基因HNF4α和E47启动子的9个TALE载体验证了方法的可行性，并鉴定出两个可用于肝癌及胰腺癌分化疗法的TALE载体。

【技术实现步骤摘要】
一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用
本专利技术属于基因调控以基因编辑
，具体涉及一种TALE表达载体及其快速构建方法和应用。
技术介绍
目前，使用最广泛的基因操作技术是锌指(ZF)，转录激活因子样效应物(TALE)和规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。ZF是最早可编程的DNA结合域，它使得ZF模块阵列能够组装成串联阵列并靶向基因组中的新型DNA结合位点。ZF阵列中的每个指模都以三个DNA碱基为目标。TALE是第二代可编程DNA结合域。并且TALE-DNA结合单体靶向单核苷酸比ZF更加模块化。TALE理论上可以针对任何序列，而且已经在许多生物体中得到应用并取得了令人瞩目的成功。更重要的是，基于TALE的DNA结合模块比ZF具有更高的序列特异性，更低的脱靶率和更低的细胞毒性。TALE是来自黄单胞菌属植物致病菌的III型效应蛋白。所有的TALE由N-末端易位结构域，C-末端核定位信号与酸性转录激活结构域和中央串联重复DNA结合结构域组成，其中中央串联重复DNA结合结构域由含有34个氨基酸序列(称为单体)的串联重复DNA识别和结合所构成。天然产生的TALE被发现具有可变数量的单体，范围从1.5到33.5不等。尽管每个单体的序列高度保守，但它们主要在两个位置上有所不同，这两个位置被称为重复可变残基(RVD，第12和第13位)。最近的报道发现这两个残基的特性决定了每个TALE重复序列的核苷酸结合特异性，并且一个简单的密码指定了每个RVD的目标碱基(NI＝A、HD＝C、NG＝T、NN＝G)。因此，每个单体靶向一个核苷酸，并且TALE中的单体的线性序列以5'至3'方向指定靶DNA序列。根据这些TALE-DNA分子编码，生物学家组装了TALE-DNA结合域蛋白并串联其他功能性蛋白质结构域融合以靶向基因组，包括内源基因的转录调控和基因组编辑。TALE是基因组操作的强大工具。2013年后，CRISPR/Cas9成为使用最广泛的基因操作技术，因为它可以很容易地设计和制备。通常，只需要准备一个表达单链向导RNA(sgRNA)载体来靶向感兴趣的DNA。然而，脱靶效应是CRISPR/Cas9基因组编辑技术的主要问题[20]。首先，由于Cas9蛋白对sgRNA的5'末端序列与靶位点之间的错配不敏感，所以，CRISPR/Cas9脱靶的风险高于ZFN和TALE核酸酶(TALEN)。其次，原间隔序列毗邻基序(PAM)序列也可以影响CRISPR/Cas9介导的基因组编辑效率和特异性。CRISPR/Cas9对靶DNA序列的作用不仅取决于sgRNA的向导，而且与侵入DNA序列中与crRNA靶序列相关的2～5ntPAM序列相关。所以它远不如TALEN准确和高效。同时，由于CRISPR引起的细胞毒性，目前它主要用于功能基因组研究。TALE是目前生物医学治疗的领先技术。事实上，第一批接受TALEN基因工程产品的患者已经表现出显著的改善，这些2015年接受治疗的患者至今仍是病情完全缓解。此后，临床试验一直显示出TALEN产品的临床潜力。目前，制约TALE使用的最大问题是其构建过程非常复杂，需要很长时间。尽管最近报道了许多装配方法，包括从GoldenGate克隆，常规克隆方法和高通量方法衍生出的一系列方法。由于TALE的重复序列性质，DNA结合单体的构建非常麻烦。之前，许多研究小组采用分层连接策略来克服将单体组装成有序多聚体阵列的困难，这是利用单体接头周围密码子简并性和IIS型限制酶的优势。然而，这些策略仍然受限于其构建TALE表达载体的繁琐和耗时的过程。因此，为了充分利用TALE的优势，简化其构建过程，使其构建过程可与CRISPR一样简单快捷，仍然有待于开发新的TALE载体构建方法。转录激活因子样效应物(TALE)曾经是有希望替代锌指的基因编辑和调控工具。然而，随着更加简单的CRISPR技术的出现，TALE因其复杂、繁琐且耗时的构建程序很快被抛弃。但随着CRISPR的广泛使用，它的致命缺点脱靶效应被逐渐发现并限制了其医学应用。而TALE由于其高靶向性已经被允许用于体内基因编辑和治疗。TALE组装试剂盒GoldenGateTALEN和TAL效应物试剂盒2.0(GoldenGateTALENandTALEffectorKit2.0，Addgene)是目前组装TALE载体使用最广泛的商业化试剂盒，但使用该试剂盒组装获得一个定制型(custom)TALE表达载体耗时达5天，而且必须是TALE研究领域经过培训的熟练技术人员才能完成。该过程的繁琐、耗时、低效是TALE技术被快速抛弃的重要原因，尽管TALE有其胜于CRISPR技术的重要优点。TALE曾经是很有前途的第二代基因调控和编辑工具，它在结合其DNA靶标时具有高度的序列特异性。由于高靶向性，TALE已被法国Cellectis用于生产通用嵌合抗原受体T(UCAR-T)细胞，该种基因工程细胞已经被FDA允许用于癌症的临床免疫治疗。然而，随着CRISPR的诞生，并且由于其应用简单，TALE很快被后者几乎完全取代。尽管如此，随着CRISPR的广泛应用，其致命的缺点，即高脱靶率，已逐渐被发现，从而限制了CRISPR的临床应用。然而研究发现TALE比CRISPR具有低脱靶率。还发现CRISPR/dCas9系统在激活内源基因表达以及应用体细胞重编程为iPS细胞方面的作用要低于TALE。但是，TALE表达载体组装构建的过程复杂、繁琐和耗时，因此TALE表达载体的组装是TALE技术广泛应用的重大技术挑战。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种TALE载体，该TALE载体可用于在一天内快速构建定制型TALE表达载体，消除现有技术中TALE应用的障碍；所构建的定制型TALE表达载体可用于激活外源报告基因和内源基因的表达。本专利技术还提供一种TALE表达载体快速构建方法和应用。本专利技术提供一种快速构建TALE载体的新方法，制备了可用一对通用引物在96孔板上扩增制备的62个新单体，并开发了一种新的TALE载体组装方案。用这些单体及组装方案可在一天内快速装配定制型TALE表达载体。本专利技术通过设计和装配针对转录因子基因HNF4α和E47启动子的9个TALE载体验证了新方法的可行性，并鉴定出两个可用于肝癌及胰腺癌分化疗法的TALE载体。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种TALE载体，所述TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，所述组装的环状5联体由62个单体经酶切-连接反应形成。其中，所述62个单体为可用一对通用引物在96孔板上进行高通量PCR扩增制备的62个单体。所述通用引物可与62个单体上结尾的恒定序列退火，用于扩增62个单体，进行62个单体的PCR扩增制备。作为优选，所述通用引物序列为TATCATCATGCCTCCTCTAGAG与TTGGTCATGGGTGGCTCGAGG。进一步地，所述62个单体为无冗余序列的线状双链DNA片段。所述62个单体均以一对恒定序列结尾，所述恒定序列为一对通用引物的退火位点。所述通用引物为TATCATCATGCCTCCTCTAGAG与TTGGTCATGGGTGGCTCGAGG。。其中，所述62个单体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TALE载体，其特征在于，所述TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，所述组装的环状5联体由62个单体经酶切‑连接反应形成。

【技术特征摘要】
1.一种TALE载体，其特征在于，所述TALE载体为由组装的环状5联体和TALE骨架载体组装形成的最终功能性TALE表达载体，所述组装的环状5联体由62个单体经酶切-连接反应形成。2.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体为可用一对通用引物进行高通量PCR扩增制备的62个单体。3.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体为无冗余序列的线状双链DNA片段。4.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体均以一对恒定序列结尾，所述恒定序列为一对通用PCR引物的退火位点。5.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体由60个碱基决定单体和2个连接单体构成，其中碱基决定单体编码的氨基酸序列可结合一种碱基，连接单体仅起TALE载体组装中的连接作用，不结合碱基。6.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述62个单体含有不同的IIS类限制酶切点，可通过酶切-连接反应按设定顺序连接。7.根据权利要求7所述的TALE载体，其特征在于，所述组装的环状5联体，包括4个环状5联体，其中第一个环状5联体由5个碱基决定单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第1～5个碱基的氨基酸序列；第二个环状5联体由5个碱基决定单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第6～10个碱基的氨基酸序列；第三个环状5联体由四个碱基决定单体和一个连接单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第11～14个碱基的氨基酸序列；第四个环状5联体由四个碱基决定单体和一个连接单体经酶切-连接反应组装而成，可编码结合TALE结合靶点的第15～18个碱基的氨基酸序列。8.根据权利要求1所述的TALE载体，其特征在于，所述TALE骨架载体优选为含有启动子、TALE恒定N端序列、TALEDNA结合序列插入位点、TALE恒定C端序列以及编码某种功能性结构域的序列。9.根据权利要求8所述的TALE载体，其特征在于，所述最终功能性...

【专利技术属性】
技术研发人员：王进科，张书衍，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32