一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法技术

本发明专利技术公开了一种载体重组及其构建方法，一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法，所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS‑2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段，融合了光合细菌基因组表达启动子PpckA基因和终止子TpckA基因，以及被广泛应用的GFP基因，基因GFP全长片段序列，基因GFP全长片段位于PBBR1MCS‑2穿梭载体ECORⅠ和SACⅠ两限制性内切酶位点之间，其构建方法包括：抽提基因组DNA、设计引物、PCR扩增、酶切、连接等步骤。本发明专利技术还包括含有上述重组载体得到工程菌，由上述重组载体经电击转化至感受态细胞得到。该工程菌稳定性高，工艺简单且对环境友好，可应用于光合细菌在植物中定殖行为的研究。

【技术实现步骤摘要】
一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法
本专利技术涉及基因工程
，具体为一种重组载体及其构建方法、荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌工程菌及制备方法和应用。
技术介绍
光合细菌，作为地球上最早出现，在自然界广泛存在的且具有原始光能合成体系的原核生物。光合细菌均为革兰氏阴性菌，其能在厌氧光照和好氧黑暗条件下利用自然界无机物和有机物作为营养生长和繁殖。近年来，光合细菌因其独特的生理功能和丰富的菌体在水产养殖，有害物质降解，废水处理，畜禽生产以及环境保护等方面取得了广泛应用。很多研究表明，光合细菌菌剂不仅能增加土壤肥力，促进植物生长，还具有抗病的功效。光合细菌菌剂作为一种药肥，其无毒，无残留，其与农业可持续发展的要求想符合。光合细菌在农业上具有促生、诱抗、农药降解、重金属吸附等作用，其极具应用开发潜力。但是长期以来缺乏直观有效的技术手段对其定殖规律及作用机制进行深入的研究。绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，以其折叠效率高，对细胞无害，稳定性好等优点，已被广泛应用于微生物的环境示踪。近年来，生防菌定殖能力的研究已经成为目前研究生防菌的重要内容，与其他放射性同位素标记和抗生素标记方法相比，GFP标记其性能稳定，灵敏度高，检测方便，已被成功用于研究各种微生物在植物中定殖。但对于光合细菌，在植物中定殖动态还未有报道。本专利技术研究目的是为了揭示这种具有生防及促生作用的有益微生物在自然界中的生态分布以及在植物体表和体内的定殖、扩展和分布规律，阐明其生防及促生作用机制并提高作用效果。本专利技术提供了一种重组载体构建方法，所述重组载体包括PBBR1MCS-2克隆载体和包含光合细菌CGA009基因组启动子和终止子的绿色荧光标记基因GFP全长片段；所述包含光合细菌基因组启动子和终止子的GFP基因全片段DNA序列为SEQIDNO.1所示的序列；所述荧光标记基因GFP全长片段位于所述PBBR1MCS-2克隆载体的KpnⅠ和EcoRⅠ两限制性酶切位点之间。通过电击转化方法将重组质粒转化至光合细菌CGA009感受态细胞，构建光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，通过其在植物上定殖来揭示光合细菌在自然界中的生态分布以及在植物体表和体内的定殖、扩展和分布规律，以阐明其生防及促生作用机制并提高其作用效果。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体的构建及其电转化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种重组载体，所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS-2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段包含光合细菌启动子和终止子，所述绿色荧光蛋白基因GFP全长位于所述PBBR1MCS-2穿梭载体的ECORⅠ和SACⅠ两限制性内切酶位点之间。一种重组载体的构建方法，包含以下步骤：S1，抽提光合细菌沼泽红假单胞菌的基因组DNA；S2，根据所述步骤S1的基因组DNA设计基因PpckA和TpckA的扩增引物；S3，根据载体pRK415载体序列设计基因GFP的扩增引物；S4，以所述S1的基因组为模板，以步骤S2的扩增引物进行多重PCR扩增得到扩增产物PpckA和TpckA片段；S5，将所述步骤S4中扩增产物TpckA连接到T载体上，得到重组载体；S6，以载体PRK415为模板，以步骤S3的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；S7，酶切S4所述扩增产物PpckA和S5重组载体，得到酶切后的扩增产物和重组载体；S8，连接酶切后的扩增产物和重组载体，得到重组基因片段载体；S9，酶切S8重组片段基因载体的扩增产物和原始载体，得到重组基因片段和酶切后的原始载体；S10，连接重组基因片段和原始载体得到前重组载体；S11，单酶切S6扩增产物和S10前重组载体；S12，将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体。优选的，S4中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,54℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环，最后延伸10min。优选的，S6中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃复性30s,72℃延伸45s,35个循环，最后延伸7min。优选的，S7中，采用限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ双酶切所述片段和载体，S8中，将酶切后扩增产物用T4DNA连接酶将两个扩增片段连接在一起并连接到T载体上，S9中，采用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切所述扩增片段和原始载体，S10中，用T4DNA连接酶将所述酶切后的扩增产物连接到原始载体上得到前重组载体，S11中，采用限制性内切酶BglⅡ单酶切所述扩增产物和前重组载体，S12中，将所述酶切后扩增片段用T4DNA连接酶连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体(工程菌)。一株光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记的工程菌，所述荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌含有权利要求1或2所述的重组载体优选的，所述工程菌在大肠杆菌培养基中培养至OD660为0.6-0.8，通过喷施，注射和灌根方法将所述工程菌施用于植物叶面，茎部和根部，观测工程菌在植物中定殖行为。优选的，所述大肠杆菌培养基为LB培养基，所述培养基为光合细菌专用培养基，培养时间为7-9天，培养温度为30℃,培养光照强度为7500Lx。荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌的制备方法，包括以下步骤：S1，制备光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞；S1，将重组载体电击转化至光合细菌沼泽红假单胞菌感受态细胞中得到荧光GFP标记的光合细菌沼泽红假单胞菌工程菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术结构设置合理，功能性强，具有以下优点：1.利用荧光GFP标记的光合细菌在植物中定殖行为观测，为工业化生产提供一直荧光表达稳定的工程菌；2.利用光合细菌GFP的蛋白表达，观测光合细菌在植物体内定殖行为；3.利用构建的工程菌生产带有荧光GFP标记的光合细菌菌株，不仅产量高，而且荧光表达稳定，对环境友好，满足其在植物定殖行为研究的要求。附图说明图1为本专利技术重组质粒PBBR1MCS-2-GFP的构建过程图；图2为本专利技术限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切原始载体PBBR1MCS-2琼脂糖凝胶电泳图；图3为本专利技术用限制性内切酶BglⅡ单酶切GFP片段琼脂糖凝胶电泳图；图4为本专利技术重组载体PBBR1MCS-2-GFPPCR验证电泳图；图5为本专利技术光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记工程菌PCR验证电泳图；图6(6.1-6.2)为本专利技术光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记工程菌荧光验证显微镜图；图7(7.1-7.8)为本专利技术光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记工程菌在植物上定殖检测图。图3中1，2，3，4，5，6均为GFP条带图4中1，2，3，4，5，6，7，8，9均为重组载体GFP验证条带具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS‑2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段包含光合细菌启动子和终止子，所述绿色荧光蛋白基因GFP全长位于所述PBBR1MCS‑2穿梭载体的ECORⅠ和SACⅠ两限制性内切酶位点之间。

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包括光合细菌沼泽红假单胞菌荧光GFP标记载体包括PBBR1MCS-2穿梭载体和绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述绿色荧光蛋白标记基因GFP全长片段包含光合细菌启动子和终止子，所述绿色荧光蛋白基因GFP全长位于所述PBBR1MCS-2穿梭载体的ECORⅠ和SACⅠ两限制性内切酶位点之间。2.根据权利要求1所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1，抽提光合细菌沼泽红假单胞菌的基因组DNA；S2，根据所述步骤S1的基因组DNA设计基因PpckA和TpckA的扩增引物；S3，根据载体pRK415载体序列设计基因GFP的扩增引物；S4，以所述S1的基因组为模板，以步骤S2的扩增引物进行多重PCR扩增得到扩增产物PpckA和TpckA片段；S5，将所述步骤S4中扩增产物TpckA连接到T载体上，得到重组载体；S6，以载体PRK415为模板，以步骤S3的扩增引物进行PCR扩增得到扩增产物；S7，酶切S4所述扩增产物PpckA和S5重组载体，得到酶切后的扩增产物和重组载体；S8，连接酶切后的扩增产物和重组载体，得到重组基因片段载体；S9，酶切S8重组片段基因载体的扩增产物和原始载体，得到重组基因片段和酶切后的原始载体；S10，连接重组基因片段和原始载体得到前重组载体；S11，单酶切S6扩增产物和S10前重组载体；S12，将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的前重组载体上得到重组载体。3.根据权利要求2所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于：S4中，所述PCR扩增条件为：94℃预变性5min,94℃变性45s,54℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环，最后延伸10min。4.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏品，翟忠英，陈丽洁，刘勇，张德咏，程菊娥，王忠勇，唐雯，孔小婷，
申请(专利权)人：湖南省植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：湖南,43