番茄红素合成相关基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了番茄红素合成相关基因及其应用。本发明专利技术通过选取来源于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粘细菌、戈壁奇球菌的四种idi和dxs，分别克隆到表达载体，将其与含有合成番茄红素基因的pTrc99aEBI质粒共同在大肠杆菌中进行异源表达，来源于粘细菌的idi、dxs基因能够有效提高番茄红素产量；在此基础上将粘细菌idi、dxs基因进行密码子优化获得idi‑dxs基因，协同表达经过密码子优化的粘细菌idi‑dxs基因来进一步提高番茄红素的合成水平。本发明专利技术获得了新的基因资源，为进一步的代谢工程改造提供了思路。

【技术实现步骤摘要】
番茄红素合成相关基因及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及番茄红素合成相关基因及其应用。
技术介绍
番茄红素是一类有40个碳原子的类胡萝卜素，其不仅具有很高的营养价值，而且具有保健功效，尤其是具有较高的抗氧化能力，能防治血管硬化、抗衰老及抑制癌细胞生长，在食品加工、医药保健、化妆品等行业用途十分广泛。目前，番茄红素的生产方法主要包括以下几种：a.天然产物提取获得，例如从胡萝卜、番茄等富含色素的植物中提取；b.利用化学法对番茄红素进行全合成；c.采用三孢布拉氏霉菌、杜氏盐藻、红法夫酵母等天然具有番茄红素合成能力的微生物进行发酵生产。但这三种方法都有相应的不足之处，如天然提取成本较高，化学合成会产生副产物，天然菌株产量较低，故应用基因工程将外源基因导入模式菌株，利用模式菌株繁殖快，产量高，遗传改造方便等特点制造番茄红素,是番茄红素生产的主要发展方向。和其他萜类化合物一样，番茄红素是以异戊烯焦磷酸(IPP)作为前体进行合成。在自然界，有两种途径合成IPP：MVA途径和MEP途径。异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyldiphosphateisomerase，IDI)和脱氧木酮糖磷酸合成酶(1-deoxyxylulose-5-phosphatesynthase，DXS)是合成番茄红素等萜类化合物的关键催化酶，也是代谢工程对萜类化合物合成途径改造的最重要的靶点之一。IDI编码大肠杆菌代谢途径中的IPP异构化酶，能够促进IPP向DMAPP的转化，通过在大肠杆菌中过表达idi基因能够有效提高番茄红素产量。IDI在基因序列及反应机制上可以分为两类，但两类IDI在代谢改造中促进番茄红素合成的作用仍不清楚。DXS编码脱氧木酮糖磷酸合成酶，主要催化丙酮酸和三磷酸甘油醛之间的反应。idi、dxs基因在萜类化合物代谢途径中发挥着重要的作用，不同来源idi、dxs基因对工程菌株产番茄红素的作用也各不相同。目前工程菌株中强化idi、dxs基因的策略往往局限在大肠杆菌来源等自身不能生产番茄红素的少数候选基因，而许多产番茄红素菌株的idi、dxs基因并没有得到表征。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新的番茄红素合成相关基因及其在提高番茄红素产量中的应用。本专利技术通过发掘、比较不同来源的idi、dxs基因，获得新的基因资源，将其与含有合成番茄红素基因的pTrc99aEBI质粒共同在大肠杆菌中进行异源表达，可以提高番茄红素产量；并协同表达经过密码子优化的粘细菌idi-dxs基因，番茄红素产量得到进一步提升，为下一步的代谢工程改造提供了新的思路。因此，本专利技术的第一个目的是提供番茄红素合成相关基因，为ECidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；或BSidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；或MXidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；或IOidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；或ECdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；或BSdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；或MXdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；或IOdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；或idi-dxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。所述的番茄红素合成相关基因编码的蛋白也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种含有所述的番茄红素合成相关基因的重组表达载体。所述的表达载体，优选为pACYCDuet-1载体。本专利技术还提供一种含有所述的番茄红素合成相关基因的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。优选，所述的基因工程菌还含有重组质粒pTrc99aEBI，其是将序列如SEQIDNO.1所示的CrtEBI基因与载体pTrc99a连接构建的重组质粒。本专利技术还提供所述的番茄红素合成相关基因在提高番茄红素产量中的应用。本专利技术通过选取来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、粘细菌(Myxococcusstipitatus)、戈壁奇球菌(Deinococcusgobiensis)的四种idi和dxs，分别克隆到表达载体，将其与含有合成番茄红素基因的pTrc99aEBI质粒共同在大肠杆菌中进行异源表达，并在此基础上将粘细菌idi、dxs基因进行密码子优化获得idi-dxs基因，协同表达经过密码子优化的粘细菌idi-dxs基因来进一步提高番茄红素的合成水平。相较于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等菌株，来源于粘细菌的idi、dxs基因对重组大肠杆菌合成番茄红素能力的促进效果具有更明显的作用。来源于粘细菌的番茄红素合成关键酶基因idi、dxs对MEP途径的强化具有更明显的作用，粘细菌idi、dxs基因通过影响合成番茄红素相关基因的表达来调控番茄红素的合成水平。协同表达经过密码子优化的idi-dxs基因，番茄红素产量得到进一步提升。与现有技术相比，本专利技术的优点是：1.本专利技术通过实验证明大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粘细菌、戈壁奇球菌idi、dxs基因对重组大肠杆菌合成番茄红素能力具有更明显的促进作用。2.本专利技术大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粘细菌、戈壁奇球菌idi、dxs基因通过调控MEP途径中IPP异构化酶和脱氧木酮糖磷酸合成酶的合成来提高菌株合成番茄红素的能力。3.本专利技术通过协同表达经过密码子优化的粘细菌idi-dxs基因来进一步提高番茄红素产量。本专利技术选用模式菌株大肠杆菌作为出发菌株，通过对不同来源idi、dxs基因进行筛选来提高番茄红素产量，证明了来源于粘细菌的idi、dxs基因优于代谢工程改造中常用的基因。目前还未见报道利用粘细菌来源基因优化MEP途径，提高番茄红素产量。这为后续代谢工程改造提供了新的基因资源。附图说明图1为番茄红素HPLC标准曲线。图2为不同来源IDI、DXSPCR扩增产物核酸电泳图，其中M为marker，图A中1-8分别依次对应为ECidi、BSidi、MXidi、IOidi和ECdxs、BSdxs、MXdxs、IOdxs目的片段，图B中1为载体pACYCDuet-1片段，2为CrtEBI基因。图3为过表达DXS或IDI重组大肠杆菌产番茄红素情况，其中A为实施1得到的成功转化质粒pTrc99aEBI的重组大肠杆菌，B为转化质粒pTrc99aEBI和pACMXDXS的重组大肠杆菌，C为转化质粒pTrc99aEBI和pACMXIDI的大肠杆菌。图4为不同来源IDI对番茄红素产量的影响，其中C为对照(实施1得到的成功转化质粒pTrc99aEBI的重组大肠杆菌)，E.CIDI、B.SIDI、M.XIDI、I.OIDI表示过表达ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI的菌株，E.CIDI+、B.SIDI+、M.XIDI+、I.OIDI+表示在培养基中添加了诱导剂的过表达ECIDI、BSIDI、MXIDI、IOIDI的菌株。图5为不同来源DXS对番茄红素产量的影响，其中C为对照(实施1得到的成功转化质粒pTrc99aEBI的重组大肠杆菌)，E.CDXS、B.SDXS、M.XDXS、I.ODXS表示过表达ECDXS、BSDXS、MXDXS、IODXS的菌株，E.CDXS+、B.SDXS+、M.XDXS+本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种番茄红素合成相关基因，其特征在于，为ECidi基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；或BSidi基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；或MXidi基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或IOidi基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；或ECdxs基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；或BSdxs基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；或MXdxs基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；或IOdxs基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；或idi‑dxs基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

【技术特征摘要】
1.一种番茄红素合成相关基因，其特征在于，为ECidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；或BSidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；或MXidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；或IOidi基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；或ECdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；或BSdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；或MXdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；或IOdxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；或idi-dxs基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。2.权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱红惠，苏卜利，杨帆，吕颖颖，姚青，李华平，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44