一种金鱼Tgf2转座酶及其制备与保存方法技术

本发明专利技术公开一种金鱼Tgf2转座酶的制备方法，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性和简并性把金鱼Tgf2转座酶中83个稀有密码子进行同义替换，进行重组表达与纯化。所获得的密码子优化的金鱼Tgf2转座酶发酵条件变得温和，而且酶活性也得到了提高，可溶性的活性金鱼Tgf2转座酶蛋白生产为鱼类转基因提供了一种选择性的工具。

【技术实现步骤摘要】
一种金鱼Tgf2转座酶及其制备与保存方法
本专利技术属于生物
，涉及具体地说，是一种表达条件温和及高活性的金鱼Tgf2转座酶的制备方法与保存方法。
技术介绍
转座子是一类可以在基因组中发生位置移动的一段DNA序列，被称为“跳跃因子”，转座子的应用在鱼类遗传育种、转基因、生物基因组的基因修饰等方面发挥着重要的作用。目前，国内外已经开展了大量关于DNA转座子的研究，结果表明具有自主转座活性的转座子所编码的转座酶不仅能够提高转座效率而且可以促进养殖鱼类的转基因以及启动子捕获研究。Tol2和Tgf2被称为DNA转座子中的“双鱼座”，其中Tol2是日本学者Koga等在白化的青鳉中发现的第一类具有自主转座活性的转座子，金鱼Tgf2是继青鳉之后的第二类具有自主转座活性的脊椎动物转座子，它们均属于hAT(hobo-AC-Tam3)超家族转座子，金鱼Tgf2转座酶是金鱼Tgf2转座子所编码的活性转座酶。但有关金鱼Tgf2密码子优化表达及其保存方法的研究还未见报道。金鱼Tgf2转座酶(Tgf2-TPase)编码区全长2061bp，其序列包括4个开放阅读框(OFR)，同时具有中间反向重复序列和末端反向重复序列等与转座相关的结构域。已经证明，用Tgf2-TPase蛋白来代替Tgf2-TPasemRNA，与供体质粒共同直接注射到胚胎中有助于提高养殖鱼类中的插入效率。之前的研究表明在大肠杆菌Rosetta1(DE3)菌株中生产重组Tgf2-TPase蛋白需要低温(22℃)、生长早期(OD600＝0.3-0.4)的这种严苛的发酵条件。菌种在生长早期易染杂菌，不利于大量发酵。本专利技术中，将重组蛋白的发酵温度提高到了30℃，OD600提高到了0.5-0.6，使其发酵条件变得温和，同时不易染杂菌。
技术实现思路
Tgf2-TPase中存在一些稀有密码子，必要地优化表达不仅可以提高生产条件，而且有可能还会增加Tgf2-TPase活性。本专利技术涉及一种表达条件温和及高活性的金鱼Tgf2转座酶的制备及保存方法，根据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对Tgf2-TPase中83个稀有密码子进行同义替换，并命名为Tgf2-TPase83，在BL21(DE3)中进行表达。经过HisTrapTMHP亲和柱纯化后用MALDI-(TOF)/TOF串联质谱进行鉴定。比较分析了-80℃下冻干酶粉、20％甘油、8％蔗糖和4％甘露醇四种不同保存方法的DNase酶活性，并用体积排阻色谱法鉴定了Tgf2-TPase83DNA结合活性及其特异性。结果显示：(1)在相同的原核表达系统中，可溶性的重组Tgf2-TPase83在30℃，OD600＝0.5–0.6，1mM的IPTG诱导6h时可大量表达；(2)经过亲和层析纯化后，与Tgf2-TPase比较，优化的Tgf2-TPase83有较高的酶活性；(3)对比四种不同的保存方法发现，将Tgf2-TPase83保存在终浓度为20％的甘油中有助于保持其DNase消化活性；(4)体积排阻色谱结果表明纯化的Tgf2-TPase83能够识别并特异性地结合含有Tgf2转座子末端反向重复(TIR)和亚末端重复(STR)序列的DNA探针。通过优化Tgf2转座酶中的83个密码子不仅使其发酵条件变得温和，而且酶活性也得到了提高，可溶性的活性Tgf2-TPase83蛋白生产为鱼类转基因提供了一种选择性的工具。本专利技术的第一个目的是针对稀有密码子难以表达的不足，提供一种发酵条件温和的表达方法。本专利技术的第二个目的是针对表达出来的蛋白杂蛋白多的不足，提供一种纯化及其鉴定的方法。本专利技术的第三个目的是针对金鱼Tgf2转座酶保存方法中的不足，提供了一种可保存其活性的方案及检测方法。本专利技术的第四个目的是针对的体外DNA结合活性不足，提供了一种鉴别金鱼Tgf2转座酶体外DNA结合活性和特异性的方法。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种发酵条件温和的Tgf2-TPase83的表达方法，包括如下步骤：(1)根据编码金鱼Tgf2转座酶的cDNA序列(JN886586)，参考大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对其中的83个密码子进行优化，命名为Tgf2-TPase83；(2)将优化后Tgf2基因序列克隆至pET28a(+)载体，由大肠杆菌DH5α克隆，进而转化至表达菌BL21(DE3)中扩大培养；(3)表达菌在BL21(DE3)中扩大培养至OD600＝0.5-0.6时加入1mM的IPTG，30℃诱导6h。为实现第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种Tgf2-TPase83的纯化方法，包括如下步骤：(1)表达后的Tgf2-TPase83在37℃、-80℃下反复冻融三次；(2)菌体超声破碎15min(功率100W，破碎3s，间隔6s)，破碎三次，共45min；(3)离心(12000g，20min，4℃)，取上清，用0.22μm膜过滤，得到的上清液用HisTrapTMHP亲和柱纯化；(4)纯化后的Tgf2-TPase83用MALDI-(TOF)/TOF串联质谱进行鉴定。为实现第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种保存Tgf2-TPase83活性的方案及其检测方法，包括如下步骤：对经过HisTrapTMHP亲和柱纯化后的Tgf2-TPase83做如下处理：(1)直接冷冻干燥；(2)加入8％蔗糖，进行冷冻干燥；(3)加入4％甘露醇，进行冷冻干燥；(4)加入20％乙醇；将上述处理后的Tgf2-TPase83在-80℃下保存。(5)不同保存方法下的Tgf2-TPase83与质粒pTgf2-EF1-EGFP混合溶于反应缓冲液中，置于30℃中分别孵育0h、1h、2h、3h、4h、5h，加入终止缓冲液终止反应，最终的反应液用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。Tgf2-TPase与质粒pTgf2-EF1-EGFP的反应作为对照。为实现第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种鉴别Tgf2-TPase83体外DNA结合活性和特异性的方法，包括如下步骤：(1)在金鱼Tgf2转座子左臂末端设计了4种含有不同重复序列数目的探针；(2)纯化后的Tgf2-TPase83与各探针在室温下共同孵育20min，用葡聚糖凝胶层析检测其DNA结合活性，单独孵育的Tgf2-TPase83作为对照；(3)蛋清溶菌酶与探针在室温下共同孵育20min，用葡聚糖凝胶层析检测其DNA结合特异性，单独孵育的蛋清溶菌酶作为对照。较为具体地，本专利技术第一方面提供了一种金鱼Tgf2转座酶，所述金鱼Tgf2转座酶的核酸编码序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术第二方面提供了一种金鱼Tgf2转座酶的制备方法，包括如下步骤：(1)金鱼Tgf2转座酶密码子的优化，根据表达宿主对密码子的偏爱性和简并性把金鱼Tgf2转座酶中稀有密码子进行同义替换；(2)重组蛋白的表达；(3)重组蛋白的纯化。在一些实施方案中，所述宿主是大肠杆菌。在一些实施方案中，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性和简并性把金鱼Tgf2转座酶中30-100个，优选50-90个，更优选83个稀有密码子进行同义替换。在一些实施方案中，金鱼Tgf2转座酶的编码序列参照GeneBank登录号：JN886586。在一些实施方案中，所述优化后的金鱼Tgf2转座酶的核酸编码序列如SEQIDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种金鱼Tgf2转座酶，其特征在于所述金鱼Tgf2转座酶的核酸编码序列如SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种金鱼Tgf2转座酶，其特征在于所述金鱼Tgf2转座酶的核酸编码序列如SEQIDNO.6所示。2.一种金鱼Tgf2转座酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)金鱼Tgf2转座酶密码子的优化，根据表达宿主对密码子的偏爱性和简并性把金鱼Tgf2转座酶中稀有密码子进行同义替换；(2)重组蛋白的表达；(3)重组蛋白的纯化。3.如权利要求2所述的金鱼Tgf2转座酶的制备方法，其特征在于，所述宿主是大肠杆菌。4.如权利要求3所述的金鱼Tgf2转座酶的制备方法，其特征在于，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性和简并性把金鱼Tgf2转座酶中30-100个，优选50-90个，更优选83个稀有密码子进行同义替换。5.如权利要求2所述的金鱼Tgf2转座酶的制备方法，其特征在于，所述金鱼Tgf2转座酶的编码序列参照GeneBank登录号：JN886586。6.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹曙明，赵茜，郑国栋，徐海丽，郑寿长，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31