一种重组卡介苗及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域和结核病疫苗技术领域。本发明专利技术提供了一类包含结核分枝杆菌基因组RD4区相关编码基因的重组卡介苗。它是将含有编码结核分枝杆菌基因组RD4区蛋白基因的重组大肠杆菌‑分枝杆菌穿梭质粒转化入卡介苗中形成的重组卡介苗。所述重组卡介苗实现了RD4区基因、蛋白的表达。免疫动物后，包涵完整RD4区的重组BCG菌株安全性不会降低，包涵部分RD4区(Rv1501‑Rv1508c)的重组BCG菌株安全性明显上升。包涵完整/部分RD4区基因的重组BCG菌株展示出更好的抗感染保护效果。该重组卡介苗可用于结核病的预防或治疗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组卡介苗及其应用
本专利技术属于基因工程疫苗和新型结核病疫苗领域。具体地说，本专利技术提供了一种新型的抗致病性分枝杆菌的重组卡介苗及其在预防和/或治疗由致病性分枝杆菌引起的感染中的应用。
技术介绍
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起的呼吸道疾病，是世界范围内单病因导致的死亡率最高的传染病。据WHO统计，全球有三分之一(约20亿人)感染了结核菌，代表着活动性结核的巨大隐患。2015年全球140万人死于结核病，1040万人新增感染结核菌(其中近63％出现结核症状)。中国是全球22个结核病高危国家地区之一，结核病患者的人数在全球排名第二(仅次于印度)，耐药结核病人数为全球第一。在全球范围内,结核病的有效控制依然面临许多困难和挑战，包括缺乏快速准确的诊断技术，缺乏有效的抗结核疫苗，和过长的结核病药物疗程(9到12个月)。而结核病和艾滋病的合并感染，以及越来越多的耐多药(MDR-TB)和广泛耐药结核(XDR-TB)的传播更加剧了结核病防控工作的严峻性。因此，急需开发安全有效的抗结核感染的新型疫苗，预计这类疫苗每年可以减少800-1000万以上新发结核病例。卡介苗(MycobacteriumbovisBCG，BCG)是迄今为止唯一被批准使用的抗结核疫苗，1974年被世界卫生组织纳入扩大免疫接种计划(EPI，ExpandedProgramonImmunization)，在全球(包括中国)广泛使用。每年有超过一亿的儿童接种卡介苗，总共接种卡介苗的人数超过40亿，使其成为人类历史上最广泛使用的疫苗。尽管已经问世使用了近100年，卡介苗有两个主要的缺陷：一是卡介苗虽然对儿童的粟粒性肺结核和结核性脑膜炎有一定的保护作用，对成人肺结核的保护效果却非常有限，临床试验的结果参差不齐(0-80％)；二是卡介苗在免疫能力低下人群中的安全性问题。基于这些因素，BCG只能在特定人群、特定时期提供保护，显然已经不是一株理想的疫苗，新一代的抗结核疫苗必须比现有的卡介苗有更好的保护效果和更优的安全性，使其能在所有的人群(包括HIV感染人群)中广泛使用。在研的重组卡介苗主要有两种，一是由UCLA的MarcusHorwitz教授实验室所构建的rBCG30，是在卡介苗中过表达抗原85B(Ag85B)的重组卡介苗。二是由德国马普研究院的StefanKaufmman教授构建的rBCG::ΔureC-llo+，是在卡介苗中表达李斯特菌(Listeriamonocytogenes)中的溶血素(listeriolysinO)使其在巨噬细胞中能够穿跃吞噬体(phagosome),进入细胞质(cytosol)，以增加抗原被T细胞识别的机会。前一种重组卡介苗(rBCG30)在2004年在美国完成临床一期实验后没有进一步的深入研究，学术界对于其只通过过表达一种抗原是否能起到很好的保护效果持怀疑态度。后一种重组卡介苗(rBCG::ΔureC-llo+)进入临床二期实验，但因为加入的融血素listeriolysin是李斯特菌的外毒素(toxin)，研究界对于其安全性和可推广性有疑虑。AERAS公司采用相似的策略在卡介苗中表达产气夹膜杆菌(Clostridiumperfringens)的溶血素(perfringolysinO)而构建的重组卡介苗[AERAS-422:BCG(ΔureC::pfoARv3407+fbpB+fbpA)]在最近的临床实验中出现安全性有问题，已经停止进一步的研究工作。这些最新的研究表明，尽管这几种重组卡介苗的研发工作开展得比较早，但并不意味着它们能成功成为新一代疫苗的组分。重组卡介苗的构建仍然需要新的思路和策略。结核分枝杆菌H37Rv的RD4区存在于MTBC的大多数成员，例如M.tuberculosis，M.africanum，M.canettii和M.microti中，是一个包含了至少11个基因(Rv1506c-1516c)的12.6kbp大小的片段。但在从阿根廷、荷兰、英国和西班牙的牛群以及人群中分离出来的常见的典型M.bovis菌株中并不存在。源自M.bovis的所有BCG菌株都不存在RD4区。申请者前期研究发现，与MTBC密切相关的鱼型分枝杆菌M.marinum的基因组中含有扩展的RD4区域，该区域包括了至少40个基因，参与脂多糖(LOS)的生物合成。因此，似乎有这样一个趋势，RD4区基因簇随着M.marinum,M.tuberculosis和M.bovis(包括BCG菌株)这样的顺序在分枝杆菌基因组中逐渐消失，可能在病原菌-宿主相互作用中发挥作用。目前，编码RD4区的大多数蛋白的功能还是未知的，但是有研究表明，这些蛋白参与了含海藻糖的糖脂类生物合成。在M.marinum扩展的RD4区中的很多基因参与到了糖基化酰基海藻糖LOSs的生物合成。Rv1511和Rv1512分别被预测为核苷糖脱水酶和差向异构酶；Rv1516c很有可能是糖基转移酶。M.marinum中的MMAR_2327是Rv1508c的同源蛋白，参与到M.marinum中LOSs的生物合成过程。M.tbH37Rv并不合成LOSs，其细胞内也没有LOSs这种脂质，然而，用转座子突变失活Rv1503c和Rv1506c基因，破坏了M.tb中2,3-二-O-乙酰基海藻糖(2,3-di-O-aceyltrehalose)的脂质合成。Rv1503c和Rv1506c失活的M.tb突变体无法诱导吞噬细胞内吞噬泡的成熟，导致其弱毒。相反，在斑马鱼胚胎感染模型中，M.marinum体内LOSs生物合成途径中的基因被破坏，增强了M.marinum毒性。因此，RD4区在分枝杆菌毒力中的作用是不同的，而这种不同似乎具有分枝杆菌物种相关性，反映出宿主与病原体之间相互作用的复杂性。推测RD4区在BCG中的表达/过表达可能改变BCG的细胞表面的特征，促进与LOS类脂类相关的PE-PGRS蛋白的分泌，从而提高疫苗抗原的呈递和保护效果。经检索，未见将结核分枝杆菌RD4相关区域重组到卡介苗中，构建表达或过表达相关基因的新型重组卡介苗的报道和专利申请。参考文献：[1]Globaltuberculosiscontrol:WHOreport2015[R].2015.[2]GunarGunther,etal.Multidrug-resistantandextensivelydrug-resistanttuberculosis:areviewofcurrentconceptsandfuturechallenges[J].ClinicalMedicine,2014,14(3):279-85.[3]TrunzBB,FineP,&DyeC(2006)EffectofBCGvaccinationonchildhoodtuberculousmeningitisandmiliarytuberculosisworldwide:ameta-analysisandassessmentofcost-effectiveness.Lancet367(9517):1173-1180.[4]ColditzGA,etal.(1995)TheefficacyofbacillusCal本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码包含结核分枝杆菌RD4区完整或部分基因的核苷酸序列，其特征在于，(1)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性；或，(2)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.2具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性。

【技术特征摘要】
1.一种编码包含结核分枝杆菌RD4区完整或部分基因的核苷酸序列，其特征在于，(1)所述核苷酸序列与SEQIDNO.1具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性；或，(2)所述核苷酸序列与SEQIDNO.2具有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％或100％同一性。2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是将编码包含结核分枝杆菌RD4区完整或部分基因的核苷酸序列插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒中构成的重组质粒。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，编码包含结核分枝杆菌RD4区完整或部分基因的核苷酸序列可来源于结核分枝杆菌的不同菌株，优选权利要求1所述核苷酸序列；所述核苷酸序列可通过PCR扩增或人工合成获得。4.一种重组卡介苗菌株，其特征在于，所述卡介苗菌株包含权利要求1所述核苷酸序列或权利要求2或3所述重组质粒。5.一种重组卡介苗疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求4所述重组卡介苗菌株或其组合；以及药学上可接受的佐剂或缓冲液体系。6.一种重组卡介苗菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1).扩增或人工合成编码完整或部分结核分枝杆菌RD4区基因的核苷酸序列；(2).将编码完整或部分RD4区蛋白的核苷酸序列插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的序列中，构建重组质粒；(3).将步骤(2)获得的重组质粒转化入卡介苗菌株中，即得到重组卡介苗菌株；步骤(1)所述核苷酸序列优选权利要求1所述核苷酸序列。7.权利要求1所述核苷酸序列、权利要求2或3所述重组质粒、和/或权利要求4所述菌株在制备抗致病性分枝杆菌感染的疫苗中的应用。8.一组多肽，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘军，张鹭，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31