一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法技术

本申请公开了一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，包括以下步骤：小麦花粉致死基因Ki的扩增；B、mVenus基因表达盒的获得；C、水稻基因表达盒的获得；D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。包括：第一步，将小麦致死基因Ki引入到pCAMBIA1300载体上，再连接mVenus基因表达元件、完整的水稻EAT1基因、小麦花粉特异性启动子Pg47到pCAMBIA1300载体上。本发明专利技术F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

【技术实现步骤摘要】
一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法
本专利技术属于基因工程遗传育种学
，具体涉及一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法。
技术介绍
水稻原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。水稻是世界上近一半的人口的主食，除可食用外，还可以酿酒、制糖和作为工业原料大。多年来的生产实践表明，杂交水稻一般可比常规稻增产20％以上，因此杂交水稻彰显着巨大的增产潜力。杂交水稻的发展依赖于杂交水稻不育系的培育。我国杂交水稻的研究始于上个世纪60年代，70年代开始大规模被种植。第一代杂交水稻是以核质互作雄性不育系为遗传工具的三系法，第二代杂交水稻是以光温敏雄性不育系为遗传工具的两系法，“三系法”和“两系法”杂交育种技术对粮食增产贡献巨大，但也存在问题。三系法中可利用的具有优良形状的父母本有限，配组不自由，野败保持系频率较低。生产上现有的不育系间遗传差异小，杂交种育性稳定性不够，抵御逆境能力较差。而“两系法”中光温敏雄性不育系的育性受外界温度控制，易导致光温敏不育系自交结实，制种失败。因此开发新一代不育系对杂交水稻的发展至关重要。小麦花粉致死基因Ki可导致特定基因型小麦雄的雄配子(花粉)发生败育夭折。Pg47启动子是小麦花粉发育后期表达的特异性启动子。利用Pg47启动子来调控Ki基因，可以水解花粉中的淀粉，从而使花粉不育。水稻EAT1基因是bHLH转录因子中的一员，bHLH转录因子大部分参与花药绒毡层的发育或小孢子发育。花药绒毡层对花粉的生长发育至关重要，绒毡层分泌的胼胝质酶能够适时地分解花粉母细胞和四分体的胼胝质壁，以保证小孢子彼此分离。
技术实现思路
本专利技术将小麦花粉致死基因Ki与水稻普通核不育基因EAT1连锁，同时以黄色荧光蛋白基因mVenus作为报告基因，对水稻EAT1突变体进行基因改造，获得F1代杂合体。F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，包括以下步骤：A、小麦花粉致死基因Ki的扩增；B、mVenus基因表达盒的获得；C、水稻基因表达盒的获得；D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。所述步骤A、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：以小麦基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦花粉致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入Msel酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。所述步骤B、mVenus基因表达盒的获得，进一步包括：以含有mVenus基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入Tru9I和KpnI位点，同时在下游引物引入的KpnI位点前面加入Msel酶切位点。所述步骤C、水稻基因表达盒的获得，进一步包括：提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整EAT1基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入SmaI和Sa1I酶切位点，其扩增的水稻EAT1基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。所述步骤D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：以小麦基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动pPG47扩增，在上下游引物中分别引入KpnI和SmaI酶切位点。所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：第一步，将小麦花粉致死基因Ki连接到pCAMBIA1300载体上；第二步，将mVenus基因连入到已经连有小麦花粉致死基因Ki的pCAMBIA1300载体上；第三步，将完整的水稻EAT1基因连接到前两步已经连接上小麦花粉致死基因Ki和mVenus基因的复合载体上；第四步，将小麦花粉特异性启动子Pg47连接到已经连接上小麦花粉致死基因Ki、mVenus基因和EAT1基因的pCAMBIA1300载体上。本专利技术提供了一种如前述任一项方法选育的基于小麦花粉致死基因K基因的转基因水稻不育系。本专利技术还提供了一种如前述任一项所述方法在基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻遗传育种中的应用。本专利技术有益效果包括：本专利技术将小麦花粉致死基因Ki与水稻普通核不育基因EAT1连锁，同时以黄色荧光蛋白基因mVenus作为报告基因，对水稻EAT1突变体进行基因改造，获得F1代杂合体。F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。附图说明图1：小麦花粉致死基因Ki的扩增凝胶电泳检测图；图2：mVenus基因完整表达盒PCR扩增凝胶电泳检测图；图3：水稻EAT1基因表达盒PCR扩增凝胶电泳检测图；图4：小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增凝胶电泳检测图；图5：植物表达载体基因连锁、转录方向和酶切位点图谱；图6：转基因植株结出的稻穗照片。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。实施例1一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，包括以下步骤：A、小麦花粉致死基因Ki的扩增；B、mVenus基因表达盒的获得；C、水稻基因表达盒的获得；D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。所述步骤A、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：以小麦基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦花粉致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入Msel酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。所述步骤B、mVenus基因表达盒的获得，进一步包括：以含有mVenus基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入Tru9I和KpnI位点，同时在下游引物引入的KpnI位点前面加入Msel酶切位点。所述步骤C、水稻基因表达盒的获得，进一步包括：提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整EAT1基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入SmaI和SalI酶切位点，其扩增的水稻EAT1基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。所述步骤D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：以小麦基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动pPG47扩增，在上下游引物中分别引入KpnI和SmaI酶切位点。所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：第一步，将小麦花粉致死基因Ki连接到pCAMBIA1300载体上；第二步，将mVenus基因连入到已经连有小麦花粉致死基因Ki的pCAMBIA1300载体上；第三步，将完整的水稻EAT1基因连接到前两步已经连接上小麦花粉致死基因Ki和mVenus基因的复合载体上；第四步，将小麦花粉特异性启动子Pg47连接到已经连接上小麦花粉致死基因Ki、mVenus基因和EAT1基因的pCAMBIA1300载体上。表1：各基因扩增用到的引物、引物中添加的酶切位点以上所述实施例，并非对本专利技术做任何形式的限制，虽然本专利技术以较本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步骤：A、小麦花粉致死基因Ki的扩增；B、mVenus基因表达盒的获得；C、水稻基因表达盒的获得；D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。

【技术特征摘要】
1.一种基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步骤：A、小麦花粉致死基因Ki的扩增；B、mVenus基因表达盒的获得；C、水稻基因表达盒的获得；D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。2.根据权利要求1所述基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤A、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：以小麦基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦花粉致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入Msel酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。3.根据权利要求1所述基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤B、mVenus基因表达盒的获得，进一步包括：以含有mVenus基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入Tru9I和KpnI位点，同时在下游引物引入的KpnI位点前面加入Msel酶切位点。4.根据权利要求1所述基于小麦花粉致死基因Ki的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤C、水稻基因表达盒的获得，进一步包括：提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整EAT1基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳音，米铁柱，张国栋，李继明，万吉丽，罗碧，葛序娟，
申请(专利权)人：青岛袁策集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37