一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法技术

本发明专利技术提供一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，首先在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体MsCRISPR/Cas9:PALM1，导入紫花苜蓿细胞并再生成苗，通过剪切后修复造成紫花苜蓿细胞MsPALM1基因出现功能缺失突变，再通过对再生株系基因组目标片段的限制性内切酶酶切和/或靶点深度测序筛选突变植株，获取携带四个等位MsPALM1基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，确认再生植株复叶由三片小叶转为五片小叶。实验表明，本方法可快速获得多叶型紫花苜蓿材料，育种周期短，所获材料除变为五出羽状复叶之外其他农艺性状不变，性状稳定，可快速获得四个等位基因均突变的可稳定遗传的纯合突变体。

【技术实现步骤摘要】
一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法
本专利技术属于紫花苜蓿生物技术育种领域，具体涉及一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法。
技术介绍
紫花苜蓿(MedicagosativaL.),是一种栽培历史悠久的多年生优质豆科牧草，具有适应性强、营养价值高、种植区域广、生态功能齐全、经济效益高等特点。它是多年生豆科牧草，是世界上种植面积最大的牧草品种，素有“牧草之王”的美誉。紫花苜蓿在我国已有两千多年的栽培历史，目前，我国紫花苜蓿种植的留床面积约146.7万多公顷。目前生产水平：干草产量平均13-17t/hm2，种子产量平均为375-600kg/hm2。所以说，中国的草产业主要是紫花苜蓿的产业化，其在农业和畜牧业发展中具有十分重要的价值和地位。培育产草量和蛋白质含量高的品种，对促进我国牧草优质生产和畜牧业发展具有重要意义。紫花苜蓿的蛋白质含量主要集中于叶片中，且叶片性状与产量性状相关。紫花苜蓿的叶子一般为三出羽状复叶，检测数据显示：紫花苜蓿60-70％的粗蛋白质和90％的维生素存在于叶片中，因此优质苜蓿应该是多叶的。由此确定了我们的育种目标为多叶性状，即通过变异获得具有多于3个小叶的多出羽状复叶的苜蓿被称为多叶型苜蓿。苜蓿多叶性状被认为具有高产和优质的潜力，培育多叶性状的优良苜蓿对开发与利用高品质苜蓿具有重要作用。苜蓿的多叶性状在自然界中也有发现，已有研究结果表明：多叶型苜蓿与三叶型苜蓿相比，其光合效率、比叶重、茎叶比等生长特性明显增加；此外，苜蓿多叶性状能增加苜蓿的叶面积，苜蓿产草量与叶面积呈正相关；多叶型苜蓿品系产草量明显高于三叶型苜蓿品种；但是苜蓿的多叶性状不稳定，苜蓿多叶性状存在隐藏现象。虽然多叶型材料品系在紫花苜蓿优质新品种培育具有广阔的应用前景，但是天然的遗传突变资源有限，且紫花苜蓿是异花授粉的同源四倍体植物，具有自交不亲和的特性，通过传统的杂交技术获得纯合的可稳定遗传的紫花苜蓿新品种，育种周期漫长，可行性不高。经检索，专利号为CN104737899B-一种航天诱变多叶型紫花苜蓿选育方法的专利，选育出我国第一个航天诱变多叶型紫花苜蓿新品种，但是这种方法成本高，条件要求十分苛刻，多代杂交选育，反复筛选，而且不稳定，所耗费时间长，可重复操作性不强。在紫花苜蓿的近源物种蒺藜苜蓿的研究成果中，我们发现调控叶原基发育的主效基因是PALM1基因，该基因为单拷贝的具有单一外显子的基因，该基因的隐性纯合突变体具有五出羽状复叶。高效的定点基因编辑技术同时沉默紫花苜蓿的四个等位的MsPALM1基因可能快速创制出具有多叶性状的可稳定遗传的紫花苜蓿新品种。因此，我们希望获得一种利用紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，同时沉默紫花苜蓿的四个等位的MsPALM1基因，快速定向获得多叶型紫花苜蓿材料。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区选取靶标片段；其中，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；步骤(2)按照靶标序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述MsCRISPR/Cas9::PALM1载体包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述靶标片段；步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基造成移码突变，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，进行限制性内切酶酶切和/或靶点深度测序；步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。优选地，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’-G(N)x-NGG-3’结构，其中，(N)x表示数目为x的一条碱基序列{N1,N2······Nx},N1,N2······Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。X一般为18或19。优选地，所述sgRNA表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核苷酸序列如SeqIDNO.1所示；所述Cas9核酸酶表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核苷酸序列如SeqIDNO.2所示。也可以说，另一方面本专利技术还提供了这种重组载体。优选地，所述sgRNA表达框包括：蒺藜苜蓿MtU6启动子，其核苷酸序列如SeqIDNO.1第1至500位所示；结构特征为G(N)x的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqIDNO.1第501至606位所示；和Poly-T终止子，其核苷酸序列如SeqIDNO.1第607至615位所示，所述Cas9核酸酶表达框包括：CaMV35S启动子，其核苷酸序列如SeqIDNO.2第1至345位所示；Cas9编码序列，SeqIDNO.2第487至4756位所示；以及tNOS终止子，SeqIDNO.2第4794至5046位所示。优选地，所述sgRNA表达框包括CRISPRRNA序列，其具有所述靶标片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或与之互补的序列。优选地，所述靶标片段的5’-G(N)x-NGG-3’中的G(N)x或与之互补的序列包含序列：5’-GGAGACGAGCACGGTCGCGG-3’，该序列为MsPALM1基因单一外显子中自翻译起始密码子ATG后第323-343位的核苷酸序列5’-CCGCGACCGTGCTCGTCTCC-3’的反向互补序列。在所选的MsPALM1基因外显子上，具有所述5’-G(N)x-NGG-3’结构的片段可选为靶标的共有19个。步骤6中所提到的功能缺失突变指的是正常MsPALM1编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。所述Cas9核酸酶表达框位于包含在所述sgRNA表达框的同一载体中。在步骤3中将所获重组载体导入苜蓿细胞，从而使细胞同时含有步骤所述靶标片段的sgRNA，Cas9核酸酶。在sgRNA和Cas9核酸酶的共同作用下，MsPALM1基因的双链靶标片段被剪切，再通过苜蓿细胞自身的DNA修复功能，最终实现细胞内MsPALM1基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。所述方法中，将重组载体导入苜蓿细胞的方法为农杆菌介导的紫花苜蓿愈伤组织稳定转化。由于在将所获重组载体导入紫花苜蓿细胞的过程中，是采用农杆菌介导的方法，重组载体被导入到紫花苜蓿的遗传DNA中，所以在进行剪切时使得紫花苜蓿的遗传DNA的片段受到剪切。在本专利技术中，所述再生植物的方法为细胞或组织经过组织培养，获得植株。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区设计靶序列；其中，所述靶序列的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；步骤(2)按照靶序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述MsPALM1靶标片段；步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1通过根癌农杆菌转化导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，使用限制性内切酶酶切检测和/或靶点深度测序检测；步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。...

【技术特征摘要】
1.一种利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤(1)在紫花苜蓿复叶发育调控基因MsPALM1外显子区设计靶序列；其中，所述靶序列的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、C、G中的任意一种；步骤(2)按照靶序列的核苷酸排列顺序，构建用于紫花苜蓿MsPALM1基因打靶的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1，所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1包含sgRNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述sgRNA表达框包含所述MsPALM1靶标片段；步骤(3)将所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9::PALM1通过根癌农杆菌转化导入紫花苜蓿细胞，使所述sgRNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在紫花苜蓿细胞中共同表达，剪切MsPALM1基因的双链的所述靶标片段，诱发所述紫花苜蓿细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内MsPALM1基因的功能缺失突变；步骤(4)，用步骤3中所述的紫花苜蓿细胞再生植株；步骤(5)，将步骤4中所得的再生植株中MsPALM1基因包含靶标片段的DNA区段进行PCR扩增后，使用限制性内切酶酶切检测和/或靶点深度测序检测；步骤(6)，选择四个等位基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的复叶表型，挑取所有复叶完全表现多于3个小叶的植株，作为所创制的多叶型紫花苜蓿材料。2.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’-G(N)x-NGG-3’结构，其中(N)x表示数目为x的一条碱基序列{N1,N2······Nx},N1,N2······Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。3.根据权利要求1所述的利用MsPALM1人工定点突变体获得多叶型紫花苜蓿材料的方法，其特征在于，所述sgRNA表达框能够在紫花苜蓿细胞内表达并且核...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海涛，王文，谢雄平，邱强，尚占环，苏克先，何辉，
申请(专利权)人：广东三杰牧草生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44