拟环纹豹蛛C家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用制造技术

技术编号:19712097 阅读:24 留言:0更新日期:2018-12-08 18:15
本发明专利技术公开了一种拟环纹豹蛛C家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用,该拟环纹豹蛛C家族杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示;拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽的氨基酸如SEQ ID NO.7‑9所示。本发明专利技术利用生物信息学分析方法,对拟环纹豹蛛转录组数据库中的基因进行筛选,获得一类相似的拟环纹豹蛛毒素的候选基因,将该基因构建到原核表达载体pET‑32a(+)中,即可获得该基因编码的杀虫肽,该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源,具有不同于Bt毒素的杀虫机制,对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源,降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险,减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。

【技术实现步骤摘要】
拟环纹豹蛛C家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用
本专利技术属于基因工程和生物防治领域,涉及一类杀虫基因及其及其编码蛋白,具体涉及一种拟环纹豹蛛C家族杀虫基因及其编码的成熟肽与应用。
技术介绍
目前广泛用于害虫防治的杀虫基因主要是苏云金芽孢杆菌产生Bt毒素的基因,Bt毒素对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等农业害虫表现出极高的杀虫特异性。因此Bt毒素基因被转基因到棉花、玉米、烟草等广泛种植的重要作物中。携带抗虫基因的转基因作物在农业害虫防治方面起着重要的作用。然而,单一抗虫基因的长期使用使害虫对Bt毒素的抗性不断增加。多种昆虫群体在自然环境下对Bt蛋白制剂和Bt转基因作物产生了抗性,如棉铃虫、小菜蛾及二化螟等(易晓莉等,昆虫对Bt毒素抗性研究进展[J],江苏农业科学,2014年第7期)。因此,开发另外一种高效环保的新型抗虫基因或蛋白质能够增加对抗虫基因的选择和降低抗性的发展。蜘蛛毒素因其化学多样性和广谱性而被作为潜在的杀虫剂受到广泛关注(G.F.King,etal.,Spider-Venompeptides:structure,pharmacology,andpotentialforcontrolofinsectpests,Annu.Rev.Entomol.2013,58:475-496.)。蜘蛛毒素能够作用于昆虫细胞膜的多种通道和受体,如离子通道、神经配体门控通道和G蛋白关联受体等。因此对多种昆虫都具有抗虫作用。但目前对蜘蛛毒素的研究多集中在黑寡妇蜘蛛中集中重要毒素的作用机制,对其杀虫作用的直接测试比较少。综上,现有对蜘蛛毒素的研究还不能满足抗虫基因的选择需求。因此需要一种具有杀虫效果的蜘蛛毒素,该毒素能够通过分子基因工程的方法大量表达或通过转基因技术在作物中表达,从而达到抗虫的效果。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术存在的问题,本专利技术提供一种拟环纹豹蛛C家族杀虫基因,通过生物学手段可获得该基因编码的成熟肽,该成熟肽作为全新的杀虫基因资源,具有神经毒性,作用于昆虫离子通道,具有不同于Bt毒素的杀虫机制,对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源,降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险,减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。本专利技术还公开拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽与应用。技术方案:为了实现上述目的,如本专利技术所述的一种拟环纹豹蛛C家族杀虫基因,所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1-3所示。本专利技术所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的的杀虫蛋白,所述杀虫蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.4-6所示。本专利技术所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽,所述成熟肽氨基酸序列如SEQIDNO.7-9所示。编码本专利技术所述的成熟肽的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因,所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.10-12所示。含有本专利技术所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因的重组质粒。本专利技术所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽在农作物害虫防治中的应用。进一步地,所述成熟肽在农作物害虫褐飞虱、灰飞虱、白背飞虱防治中的应用。含有本专利技术所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂。本专利技术所述的含拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽的杀虫剂在农作物害虫防治中的应用。本专利技术参考黑寡妇等蜘蛛的毒素基因,利用生物信息学分析方法,对拟环纹豹蛛转录组数据库中的基因进行筛选,获得一类相似的拟环纹豹蛛毒素的候选基因,然后利用多聚酶链式反应(PCR)及Sanger法测序,获得其中一个基因的完整序列。将该基因构建到原核表达载体pET-32a(+)中,经原核系统表达,即可获得该基因编码的成熟肽即为杀虫肽。制备周期短,氨基酸序列小,适合体外大规模生产,同时,该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源,具有不同于Bt毒素的杀虫机制,对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源,降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险,减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。有益效果:与现有技术相比,本专利技术具有如下优点:本专利技术采用的拟环纹豹蛛作为农业害虫天敌,长期以昆虫为食,其毒素主要作用于昆虫,对脊椎动物相对安全。本专利技术通过拟环纹豹蛛筛选到全新的拟环纹豹蛛A家族杀虫基因,根据该基因通过生物学手段可获得该基因编码的成熟肽即为杀虫肽,该杀虫肽作为全新的杀虫基因资源,具有神经毒性,作用于昆虫离子通道,具有不同于Bt毒素的杀虫机制Bt毒素作用于昆虫围食膜,对拓展具有生物活性的新型杀虫基因资源,降低现有Bt毒素广泛使用存在的各类安全风险,减少杀虫剂的使用具有重要的科学及现实意义。本专利技术预测拟环纹豹蛛毒素的成熟肽,并成功构建表达载体,优化诱导条件,使蛋白产量最大化,同时优化纯化条件,减少蛋白损失。此外,本专利技术采用的体外表达体系高效且产量高,得到的杀虫肽纯度高,且具有较高活性。本专利技术制备的重组毒素具有较高的杀虫活性。附图说明图1为注射CK和重组毒素PPTX-01后,褐飞虱在不同时间点的死亡率示意图;图2为注射CK和重组毒素PPTX-01后,灰飞虱在不同时间点的死亡率示意图;图3为注射CK和重组毒素PPTX-01后,白背飞虱在不同时间点的死亡率示图。具体实施方式以下结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。实施例中所设计的试剂和培养基配方:(1)LB液体培养基:在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物和5gNaCl,搅拌混匀,用双蒸水定容至1L,置于高压灭菌锅中,121℃,灭菌20min,冷却后置于4℃保存。(2)LB固体培养基:在900ml双蒸水中加入10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物,5gNaCl和15g琼脂,搅拌混匀,用双蒸水定容至1L,置于高压灭菌锅中,121℃,灭菌20min,冷却后至50℃加入终浓度为100mg/L的羧苄青霉素,倒板,冷却后置于4℃保存。(3)转膜缓冲液:甘氨酸2.9g,Trisbase0.8g,SDS0.37g,甲醇200ml,加入双蒸水定容至1L。(4)PBST:PBS中加入0.05%体积的吐温-20。(5)封闭液:PBST中加入1%的脱脂奶粉。(6)Tris-HCl:将1M的Tris-HCl稀释至20mM。(7)结合缓冲液:20mM磷酸钠,0.5M氯化钠,10mM咪唑,双蒸水定容至1L,pH7.4。(8)洗脱缓冲液:20mM磷酸钠,0.5M氯化钠,500mM咪唑,双蒸水定容至1L,pH7.4。实施例1毒素的制备蜘蛛毒素基因的设计和构建拟环纹豹蛛采自江苏省南京市浦口区水稻田,并在室内用褐飞虱饲养90天后,取毒腺并进行转录组测序,根据注释结果,筛选出拟环纹豹蛛毒素基因,根据其半胱氨酸的数量、排列方式、结构域预测和序列分析,获得一类拟环纹豹蛛毒素的候选基因,并选取其中的一种,即PPTX-01,其碱基序列如SEQIDNO.1所示,其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示,通过SpiderP(http://www.arachnoserver.org/spiderP.html)预测其信号肽、前肽和成熟肽,将其成熟肽序列按照大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化,设计出用于在大肠杆菌中表达的PPTX-01毒素基因序列如SEQIDNO.10所示,设计完成的基因由Invitrogen公司合成,并在南京金斯瑞公司完成测序,将合成的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-3本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种拟环纹豹蛛C家族杀虫基因,其特征在于,所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示。

【技术特征摘要】
1.一种拟环纹豹蛛C家族杀虫基因,其特征在于,所述杀虫基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1-3所示。2.一种权利要求1所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的的杀虫蛋白,其特征在于,其氨基酸序列如SEQIDNO.4-6所示。3.一种权利要求1所述的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因编码的成熟肽,其特征在于,所述成熟肽氨基酸序列如SEQIDNO.7-9所示。4.一种编码权利要求3所述的成熟肽的拟环纹豹蛛C家族杀虫基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员:刘泽文黄立鑫于娜王照英鲍海波
申请(专利权)人:南京农业大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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