能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用制造技术

本发明专利技术提供两种能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因，在猪LamR基因中一个能有效抑制猪瘟猪瘟病毒吸附的位点，且该位点的突变能用于抑制猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用。利用CRISPR/Cas9介导的精确点突变技术，成功的对猪LamR基因进行了精确的点突变修饰，突变后的LamR基因增强了猪体抵抗猪瘟的能力；本发明专利技术在引入该点突变过程中没有引入任何的外源的启动子基因及正负筛选标记基因，大大的增加的转基因猪的安全性，对去除转基因猪农产品的生物、食品安全隐患具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因及应用
本专利技术公开了能有效的抑制猪瘟病毒感染的精确突变的LamR基因的突变位点及氨基酸序列，同时还公开了猪LamR基因272位氨基酸的精确突变在抗猪瘟病毒研究中的应用，属于生物工程
技术背景层粘连蛋白受体（Lamininreceptor,LamR）由295个氨基酸分子组成，编码为885bp。依据其分子量大小，LamR可分为37kDa（37-kDaLamR）和67kDa（67-kDaLamR）两种形式。目前认为，37-kDaLamR是67-kDaLamR的前体，大量分布于细胞质中，是一种多功能蛋。67-kDaLamR实际上是由同一基因表达的具有多功能的蛋白质，既可以介导细胞与细胞外基质的粘附作用，又可以作为核糖体的一种组成成分，参与了核糖体的组装、成熟过程，同时又与肿瘤的多药耐药性有关。而且在生物进化过程中具有严格的保守性，提示该蛋白可能具有更为重要的生物学功能。67-kDaLamR还与多种病原体的侵入相关，包括辛德比斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、DeV、腺联病毒等。近期有研究人员确定，LamR是猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）的吸附受体，LamR与已知CSFV受体HS相互协同，通过与猪瘟病毒的Erns蛋白结合来入侵宿主细胞以此来介导CSFV感染。基因组定点编辑技术是实现动物品种改良和构建人类疾病动物模型的重要研究工具，与传统的转基因技术相比，基因编辑技术不依赖于胚胎干细胞，能够应用于更多物种，并且具有效率高、定向修饰精确、所需时间短以及得到的突变可以稳定遗传等优点。最近，在基因组定点修饰方面有了突破性的进展，科学家发现了一种新的基因组定点编辑技术——CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统是利用RNA引导核酸酶对基因组DNA进行定点修饰，现已广泛地应用于小鼠、斑马鱼、猪、羊等多个物种，暗示CRISPR/Cas9基因组编辑技术能够摆脱动物无干细胞系的限制，并且可在任何动物中实现定向、精准的基因修饰。由于是通过CRISPR/Cas9为基础的点突变技术制备而来，进一步降低了转基因食品安全问题，提供了市场支撑。同时，本专利技术有利于对CSFV感染机制及感染周期的理解，在减少CSF危害的同时也可为病毒性疾病的治疗及药物靶点研究提供参考。
技术实现思路
本专利技术提供两种能有效抑制猪瘟病毒感染的精确突变LamR基因，在猪LamR基因中一个能有效抑制猪瘟猪瘟病毒吸附的位点，且该位点的突变能用于抑制猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用。本专利技术所提供了一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列，其特征在于：该sgRNA的RNA序列如：SEQID1所示，互补链的RNA序列如：SEQID2所示。本专利技术还提供了一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列，其特征在于：该sgRNA的DNA序列如SEQID3所示，互补链的DNA序列如：SEQID4所示。本专利技术上述的能有效的抑制猪瘟病毒的感染精确突变的猪LamR基因的制备方法，包括以下步骤：1）在基因库中调出猪LamR基因的序列，根据PAM序列（NGG）选择用于基因编辑的sgRNA靶向的区域；2）根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列，该引物的DNA序列如SEQID3所示，互补链的DNA序列如：SEQID4所示；3）引物退火形成寡聚核苷二聚体（oligoduplex）；4）将寡核苷酸二聚体连接到相应的质粒载体中，即可获得sgRNA的表达载体；5）筛选出具有较高切割效率的sgRNA；6）根据筛选的sgRNA的切割位点设计单链的核苷酸载体（Donor），猪LamR基因第272位苏氨酸突变为丙氨酸的单链核苷酸载体的DNA序列如SEQID5所示，猪LamR基因第272位苏氨酸突变为丙氨酸的单链核苷酸载体的DNA序列如SEQID6所示；7）将sgRNA和单链核苷酸Donor同时通过转染的方法引入到细胞中，后续再结合细胞筛选及鉴定技术即可获得两种猪LamR基因精确定点突变的细胞克隆。本专利技术所述的猪LamR基因272位氨基酸的精确突变在抗猪瘟病毒中的应用，其特征在于：猪LamR基因272位氨基酸突变能有效抑制猪瘟病毒的吸附作用在制备抑制猪瘟病毒的感染药物中的应用，以及在构建抗猪瘟病毒细胞系和制备精确点突变抗猪瘟病毒基因编辑猪中的应用。本专利技术将LamR蛋白的272位苏氨酸突变为丙氨酸，即将272位氨基酸-苏氨酸对应的密码子TGG中的胸腺嘧啶（T）精确突变为C（胞嘧啶），或者将将272位氨基酸-苏氨酸对应的密码子TGG中的胸腺嘧啶（T）精确突变为A（腺嘌呤）能有效阻止猪瘟病毒对宿主细胞的吸附作用，从而增强猪体抵抗猪瘟病毒的能力。本专利技术通过CRISPR/Cas9为基础的精确点突变技术成功的筛选获得了LamR点突变的细胞系，接着对这些突变的细胞克隆进行病毒接种实验，结果证实这些点突变的细胞系能有效的抵抗CSFV的侵入。本专利技术的积极效果在于：利用CRISPR/Cas9介导的精确点突变技术，成功的对猪LamR基因进行了精确的点突变修饰，突变后的LamR基因增强了猪体抵抗猪瘟的能力；本专利技术在引入该点突变过程中没有引入任何的外源的启动子基因及正负筛选标记基因，大大的增加的转基因猪的安全性，对去除转基因猪农产品的生物、食品安全隐患具有重要意义。附图说明：图1：猪LamR基因精确点突变的序列信息及突变示意图；图2：高效切割的sgRNA的筛选；图3：细胞克隆的筛选及测序鉴定；图4：通过酶切及电泳来鉴定精确点突变的细胞克隆；图5：IFA法评估各点突变猪胎儿成纤维细胞克隆抗猪瘟病毒的能力；图6：IFA法评估各点突变PK-15细胞克隆抗猪瘟病毒的能力；图7：免疫荧光检测分析突变细胞克隆中的LamR基因表达情况。具体实施方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例11-1、猪LamR基因精确点突变的序列信息及突变示意图对猪、人、小鼠、牛、羊等多个物种LamR的氨基酸序列进行同源性比对，发现LamR在不同物种间存在高度的保守性。利用NCBI获得猪LamR基因的完整序列,查找出LamR基因的转录本，编码框，编码蛋白等信息并通过Esemble(http://ensembl.org.index.html)网站对该基因的生物学信息进行核实。确定了突变的位点及sgRNA的编辑区域；参见图1：AA为LamR的氨基酸序列；绿色下划线对应的序列为sgRNA的把向序列；T为翻译链对应的DNA序列，NT为非翻译链对应的序列；T>A为苏氨酸突变为丙氨酸；T>S为苏氨酸突变为丝氨酸；蓝色字母为野生型的碱基，红色字母表示突变的碱基（注：除苏氨酸（Thr）为目的突变外，其它红色标注的碱基突变均为同义突变。、sgRNA序列的设计及PX330表达载体的构建及筛选设计并合成了2条针对猪ROSA26位点的sgRNA序列。上述设计完成的shRNA序列合成；4条单链的sgRNA的DNA序列分别经过退火后形成2条靶向猪LamR基因的sgRNA的寡核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列，其特征在于：该sgRNA的RNA序列如：SEQ ID 1所示，互补链的RNA序列如：SEQ ID 2所示。

【技术特征摘要】
1.一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列，其特征在于：该sgRNA的RNA序列如：SEQID1所示，互补链的RNA序列如：SEQID2所示。2.一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的DNA序列，其特征在于：该sgRNA的DNA序列如SEQID3所示，互补链的DNA序列如：SEQID4所示。3.如权利要求1或2所述的一种能有效编辑猪LamR基因的sgRNA的RNA序列的制备方法，包括以下步骤：1）在基因库中调出猪LamR基因的序列，根据PAM序列（NGG）选择用于基因编辑的sgRNA靶向的区域；2）根据靶位点的序列，设计并合成对应的引物序列；3）引物退火形成寡聚核苷二聚体（oligoduplex）；4）将寡核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳红生，谢子聪，逄大欣，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22