敲减人IL-15的siRNA、CD19 CAR表达载体、CAR-T细胞及构建方法和应用技术

技术编号:19712072 阅读:39 留言:0更新日期:2018-12-08 18:14
本发明专利技术公开了敲减人IL‑15的siRNA、CD19 CAR表达载体、CD19 CAR‑T细胞及应用,涉及肿瘤免疫治疗技术领域,基于没有方法控制CD19 CAR‑T细胞自身激活增殖释放的IL‑15的问题而提出的。本发明专利技术包括一种敲减人IL‑15的siRNA、siRNA的慢病毒表达载体、敲减IL‑15的CD19 CAR‑T细胞。本发明专利技术的有益效果在于:实现CD19 CAR‑T细胞中IL‑15的敲减效果,极大程度减少IL‑15的分泌量,从而降低细胞因子释放综合征和脑水肿的风险。

【技术实现步骤摘要】
敲减人IL-15的siRNA、CD19CAR表达载体、CAR-T细胞及构建方法和应用
本专利技术涉及肿瘤免疫治疗
,具体涉及一种敲减人IL-15的siRNA、CD19CAR表达载体、CAR-T细胞及应用。
技术介绍
2017年初,国家癌症中心发布了中国最新癌症数据,每一项数据都用客观的事实告诉我们:中国正在面临一场抗癌战争。每天约1万人诊断癌症,每分钟约7人确诊患癌。癌症新发人数继续上升,从358万增加到368万,增幅3%;世界新发病例约1409万,中国新发癌症病例占世界的1/4。我国癌症的治疗面临着巨大的挑战,目前传统的疗法主要有手术、化疗、放疗和靶向疗法,在一些癌症的治疗方面有一定的作用,但对于很多癌症的治疗效果非常局限。癌症的免疫疗法(CancerImmunotherapy)是继手术、化疗、放疗和靶向疗法之后出现的一种新型治疗方法,它是利用患者自身免疫系统的力量来抵抗癌症,所有癌症的发生从逻辑上都需要突破免疫系统的监视,而免疫疗法主要通过增强机体免疫系统功能,来消灭肿瘤细胞。免疫治疗经历了多年的不断发展,近几年取得了越来越多令人鼓舞的研究成果,包括针对免疫监控点分子或靶向抗原的单抗,双特异性抗体,肿瘤疫苗等,而在众多免疫疗法中,最受瞩目且具前景的当属嵌合抗原受体T细胞免疫疗法,它是免疫疗法与基因疗法相结合的创新疗法。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)即CAR-T技术是通过将识别肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen,TAA,是指一些肿瘤细胞表面糖蛋白或糖脂成分,它们在正常细胞上有微量表达,但在肿瘤细胞表达明显增高的scFv(单链抗体可变区片段)、跨膜区片段(CD8、CD28)、胞内信号分子(CD3ξ),共刺激因子(CD28、4-1BB、OX40)在体外进行基因重组,生成重组载体,再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞,使患者T细胞表达嵌合抗原受体。转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞,也即CAR-T细胞,这些嵌合抗原受体修饰后的T细胞具备特异杀伤患者体内肿瘤细胞的能力。T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用,在肿瘤免疫应答中起主要作用,但是肿瘤细胞表面的MHC在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况,这样长期形成的免疫逃逸机制能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击,肿瘤快速增殖。此外,人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少,并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原,使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除,数量进一步减少。而CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力,这种靶向杀伤的特异性来自于识别肿瘤相关抗原的单链抗体与其抗原的特异性结合,而不需要通过传统的抗原呈递免疫激活途径,从而克服肿瘤细胞通过下调MHC分子表达以及降低抗原递呈等免疫逃逸,打破宿主的免疫耐受。所以,它是针对肿瘤治疗的一种优势明显的精准医疗策略。从全球大量开展的CAR-T临床实验来看,CAR-T技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效,而在实体瘤方面,有一些令人鼓舞的突破,但还面临着诸多难点问题需要攻克。美国各大医学研究机构开展的CD19CAR-T疗法治疗急性淋B淋巴细胞白血病或者淋巴瘤的临床有效率都达到80%左右。在CAR-T临床实验中,最受瞩目的焦点案例是5岁的急性淋巴细胞白血病儿童EmilyWhitehead接受了宾夕法尼亚大学的CarlH.June研究组的CAR-T-19细胞的回输,病情已经完全缓解,体内检测不到白血病细胞,而且9岁的Emily体内仍然能检测到CAR-T细胞,这项研究在全球范围引起巨大的轰动,为肿瘤的临床治疗指明了新的方向。当前,美国FDA已经批准了诺华公司针对急性淋B淋巴细胞白血病的CD19CAR-T细胞产品以及凯特公司针对弥漫性B细胞淋巴瘤的CD19CAR-T细胞产品。虽然在临床试验过程中,CD19CAR-T细胞产品会带来一些不良反应,包括细胞因子风暴,神经毒性等症状,但是目前对这些症状已有比较好的临床应对措施,而JUNO公司在同类产品CAR015疗法的临床研究中,有多名患者在研究过程中不幸去世。经过后续研究,最新分析结果表示导致患者死亡的原因是脑水肿,这些症状与CAR-T细胞的过快增长有关,一般理想状态下,CAR-T细胞回输体内在11、12、14天的时候,扩增达到顶峰能够避免脑水肿症状出现,而当患者体内IL15水平升高,CAR-T细胞就会过早、过快的出现扩增,尤其是当CAR-T细胞被激活增殖后,也会分泌各种细胞因子,包括IL15,进一步放大扩增效果。此外,作为CAR-T疗法主要的不良反应细胞因子风暴甚至细胞因子释放综合征,也是CAR-T疗法临床应用关注的焦点,是由淋巴细胞释放多种细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、等导致的,其中IL15在细胞因子释放综合征中也扮演着重要的角色。白细胞介素-15(IL-15)是与白细胞介素-2(IL-2)结构相似的细胞因子。像IL-2一样,IL-15与IL-2/IL-15受体β链(CD122)和普通γ链(γ-C,CD132)组成的复合物结合并进行信号传导。在被病毒感染后,单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌IL-15。该细胞因子诱导天然杀伤细胞的细胞增殖,其主要作用是杀死病毒感染细胞的先天免疫系统细胞,此外,IL-15调节T淋巴细胞的活化和增殖,在不存在抗原的情况下维持记忆T细胞的生存信号由IL-15提供。在啮齿类淋巴细胞中,IL-15通过诱导凋亡途径抑制剂BCL2L1/BCL-x(L)来阻止细胞凋亡;在人类免疫系统中,IL-15通过诱导Bcl-2和/或Bcl-xL类似地抑制T-淋巴细胞的凋亡。因此,为了降低细胞因子综合征和脑水肿的风险,可通过采用温和的化疗方案进行淋巴细胞清除预处理,来降低患者体内的IL-15的水平,而CAR-T细胞自身激活增殖释放的IL-15却没有方法进行控制。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题在于没有方法控制CD19CAR-T细胞自身激活增殖释放的IL-15。本专利技术是采用以下技术方案解决上述技术问题的:一种敲减人IL-15的siRNA,所述siRNA为:a.正义链序列如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列,反义链序列如SEQIDNO.2所述的核苷酸序列。本专利技术还提供所述siRNA在CD19CAR-T细胞中的应用。本专利技术还提供一种敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体,所述表达载体包含如权利要求1所述的siRNA。优选的,所述表达载体为CD19CAR的pCDH慢病毒表达载体。本专利技术还提供一种敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法,包括以下步骤:(1)CD19CAR的pCDH质粒载体的构建;(2)将所述siRNA序列克隆进入CD19CAR的pCDH质粒载体中,获得敲减IL-15重组pCDH慢病毒质粒载体;(3)敲减人IL-15的重组pCDH慢病毒载体的包装。优选的,所述步骤(1)中CD19CAR采用二代CAR的组成方式,所述CD19CAR由识别CD19分子的scFv片段,CD8跨膜区,4-1BB片段,CD3ζ片段组成,所述CD19CAR序列如SEQIDNO.9所示。优选的,所述步骤(2)中使用NotI与本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种敲减人IL‑15的siRNA,其特征在于:所述siRNA为:a.正义链序列如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列,反义链序列如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种敲减人IL-15的siRNA,其特征在于:所述siRNA为:a.正义链序列如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列,反义链序列如SEQIDNO.2所述的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的敲减人IL-15的siRNA的应用,其特征在于:所述siRNA在CD19CAR-T细胞中的应用。3.根据权利要求1所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体,其特征在于:所述表达载体包含如权利要求1所述的siRNA。4.根据权利要求3所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体,其特征在于:所述表达载体为CD19CAR的pCDH慢病毒载体。5.根据权利要求4所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法,其特征在于:其构建方法包括:(1)CD19CAR的pCDH质粒载体的构建;(2)将所述siRNA序列克隆进入CD19CAR的pCDH质粒载体中,获得敲减IL-15重组pCDH慢病毒质粒载体;(3)敲减人IL-15的重组pCDH慢病毒载体的包装。6.根据权利要求5所述的敲减人IL-15的siRNA的重组慢病毒表达载体的构建方法,其特征在于:所述步骤(1)中CD19CAR采用二代CAR的组成方式,所述CD19CAR由识别CD19分子的scFv片段,CD8跨膜区,4-...

【专利技术属性】
技术研发人员:徐华栋刘振云韩江萌王维程丰伟
申请(专利权)人:安徽古一生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:安徽,34

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