一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体技术

本发明专利技术公开了一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体。同源重组载体，包括插入原始载体的插入片段，插入片段包括斑马鱼心脏特异表达的启动子、融合LoxP位点序列的左侧同源臂和右侧同源臂、多克隆位点、内部核糖体进入位点、报告基因、转录终止信号片段；其中，所述启动子位于报告基因上游，所述终止信号位于报告基因下游，左侧同源臂位于启动子上游，右侧同源臂位于终止信号下游，同源臂的内侧含有LoxP序列，多克隆位点位于所述启动子和报告基因之间；左侧同源臂和右侧同源臂靶向斑马鱼色素基因。还提供了斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法，本发明专利技术可用于快速建立斑马鱼心脏特异表达基因的转基因模型，同时可以调控插入片段的表达。

【技术实现步骤摘要】
一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体。
技术介绍
斑马鱼是目前应用广泛的一种模式动物，在发育生物学领域具有举足轻重的地位。斑马鱼在胚胎发育研究中，有很多优越性，其胚胎发育快，器官发育进程明显，易于追踪检测。目前已经用于的心脏模型、脑模型、肝脏模型、眼模型等的构建，是热门的动物模型，特别是在发育生物学领域。随着双光子干涉显微镜的应用，在体实时观察成为有效的手段。在分子生物学研究中，用CRISPR/Cas9技术产生DNA的双链缺失，提供了新的基因敲除、基因敲入和各种基因组重排，如染色体缺失、反转、重复和易位的途径。目前，迅速发展的微同源末端接合MMEJ机制，已经发现可以替代传统的双链缺失修复途径，稳定地用于工具酶介导的基因敲除实验。进一步的研究表明NHEJ，HR和MMEJ在不同的细胞核动物模型中双链缺失修复效率是不同的，MMEJ在哺乳动物细胞和模式动物，如斑马鱼小鼠、大鼠、等，表现得更加高效。Cre/LoxP技术，包括Cre重组酶由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质，它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别LoxP位点；LoxP位点长为34bp，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。目前尚未有斑马鱼心脏模型构建的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体，该方法是一种CRISPR/Cas9介导的、在斑马鱼色素基因内整合心脏特异表达的启动子，启动下游荧光报告基因等的表达可以通过显微镜捕捉荧光信号，同时通过色素衰退辅助筛选，构建成斑马鱼心脏特异表达模型，待斑马鱼成年后，通过对下一代斑马鱼受精卵注射Cre酶，可以特异性将LoxP位点之间引入的外源序列删除，恢复色素基因表达，达到对插入片段的调控表达。其主要原理是：首先应用CRISPR/Cas9技术，在斑马鱼色素基因内靶向剪切形成双链断裂，结合MMEJ机理提高微同源重组的效率，将外源片段引入；其次，构建的同源重组载体是针对色素基因设计的，敲除色素基因后可以影响色素合成导致斑马鱼黑色素合成障碍，不但可以作为辅助筛选标记，而且利于心脏的观察；再次，利用MMEJ机理将靶点两侧上下游各40bp作为同源序列，同时加入EGFP报告基因或者需要在心脏特异表达的目的基因，通过获得EGFP表达的阳性斑马鱼个体，从而构建成可以通过荧光实时检测的斑马鱼心脏特异表达模型；最后，利用Cre/LoxP技术，待斑马鱼成年后，通过对下一代斑马鱼受精卵注射Cre酶mRNA或者表达Cre的斑马鱼品系进行交配，可以特异性将同向排列的LoxP位点之间引入的外源序列删除，恢复色素基因表达，达到对插入片段的调控表达。依靠以上优势，可以快速构建斑马鱼心脏特异表达模型，同时可以调控插入基因的表达。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种插入片段，包括斑马鱼心脏特异表达的启动子、融合LoxP位点序列的左侧同源臂和右侧同源臂、内部核糖体进入位点、报告基因、转录终止信号片段；其中，所述启动子位于报告基因上游，所述终止信号位于报告基因下游，左侧同源臂位于启动子上游，右侧同源臂位于终止信号下游，同源臂的内侧(即3’端)含有LoxP序列；左侧同源臂和右侧同源臂靶向斑马鱼色素基因。插入片段还可以包括位于所述启动子和报告基因之间的多克隆位点，多克隆位点可以用于插入外源目的基因，研究该外源目的基因对心脏发育的影响研究。插入片段也即同源重组基因片段，具体的，所述的左侧同源臂和右侧同源臂之间依次设有以下所述的元件：斑马鱼心脏特异表达的启动子、多克隆位点、内部核糖体进入位点、报告基因和转录终止信号片段。所述启动子为Ztnnt2-promoter，其核苷酸序列为如SEQIDNO.21所示。可选地，Cre/LoxP位点或称LoxP位点，本专利技术中使用的同链同向时删除插入片段的调控模式，如研究人员有需要可以使用其他三种特性，进行表达的调控，分别是：两个LoxP位点共链反向时，Cre重组酶诱导LoxP间的序列翻转；两个LoxP位点异链或异染色体时，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；当四个LoxP位点分别位于异链或异染色体上，Cre重组酶诱导LoxP间的序列互换。Cre酶编码区的序列如SEQIDNO.27所示。可选地，所述的报告优选荧光报告基因；如EGFP基因(EnhancedGreenFluorescentProtein)(SEQIDNO.22)、GFP、RFP、YFP、mCherry等任意荧光蛋白基因；可选地，所述的转录终止信号为SV40polyA(Simianvacuolatingvirus40polyA)、其核苷酸序列为SEQIDNO.24，其他的终止信号也可以如β-globinTeminator或者BGHpolyA(BovinegrowthhormonepolyA)，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.25和SEQIDNO.26。内部核糖体进入位点(Internalribosomeentrysite,IRES)的序列如SEQIDNO.28。优选地，左侧同源臂和右侧同源臂使用的是MMEJ方式进行微同源重组，效率更高，靶向斑马鱼色素基因，包括但不限于使用Tyrosinase基因(Daniorerio,GeneID:30207)作为靶向基因，其优点如下：1)它是目前斑马鱼已知的编码酪氨酸酶的基因；2)它的作用主要体现在影响黑色素生成，研究表明该表型不会影响胚胎个体的发育；3)作为靶标基因，突变后在斑马鱼胚胎发育早期24hpf-120hpf，有着及其明显的白化表型，易于进行斑马鱼心脏的在体观察。本专利技术还提供了含有所述插入片段的同源重组载体、细胞或工程菌。重组载体包括原始载体及插入原始载体的上述插入片段；其中，原始载体可以但不限于T载体。一种同源重组载体的构建方法如下：以斑马鱼cDNA为模板，以Ztnnt2-F和Ztnnt2-R为引物进行扩增后，再以该扩增产物为模板，以LZ-F和LZ-R为引物进行第二轮扩增，得片段1；用特异性引物从pIRES2-EGFP(Clontech，PT3267-5)载体上扩增IRES-EGFP-PA，与上述片段1进行连接，然后连入用NcoI和SpeI酶切的pGEM-Teasyvector中。本专利技术还公开了一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法，包括：1)构建所述的同源重组载体，获得所述插入片段；2)设计针对同源臂靶向基因的特异性靶点，合成相应的sgRNA，合成Cas9-mRNA；3)将所获得sgRNA、Cas9-mRNA和插入片段转入斑马鱼受精卵中，筛选转基因斑马鱼。步骤3)中，在斑马鱼发育至24hpf(hourspostfertilization)早期心脏搏动开始，即可以筛选获得心脏表达EGFP基因的阳性个体，24hpf后由于色素基因被阻断表达，阳性个体无色素沉积，利于心脏在体观察检测。在斑马鱼成年后，筛选实验需求的特定心脏表型，通过Cre酶可以特异性将LoxP位点之间引入的外源序列删除，恢复色素基因的表达，达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种插入片段，其特征在于，包括斑马鱼心脏特异表达的启动子、融合LoxP位点序列的左侧同源臂和右侧同源臂、内部核糖体进入位点、报告基因、转录终止信号片段；其中，所述启动子位于报告基因上游，所述终止信号位于报告基因下游，左侧同源臂位于启动子上游，右侧同源臂位于终止信号下游，同源臂的内侧含有LoxP序列；左侧同源臂和右侧同源臂靶向斑马鱼色素基因。

【技术特征摘要】
1.一种插入片段，其特征在于，包括斑马鱼心脏特异表达的启动子、融合LoxP位点序列的左侧同源臂和右侧同源臂、内部核糖体进入位点、报告基因、转录终止信号片段；其中，所述启动子位于报告基因上游，所述终止信号位于报告基因下游，左侧同源臂位于启动子上游，右侧同源臂位于终止信号下游，同源臂的内侧含有LoxP序列；左侧同源臂和右侧同源臂靶向斑马鱼色素基因。2.根据权利要求1所述的插入片段，其特征在于，还包括位于所述启动子和报告基因之间的多克隆位点。3.根据权利要求2所述的插入片段，其特征在于，所述的左侧同源臂和右侧同源臂之间依次设有以下所述的元件：斑马鱼心脏特异表达的启动子、多克隆位点、内部核糖体进入位点、报告基因和转录终止信号片段。4.根据权利要求1所述的插入片段，其特征在于，斑马鱼色素基因为斑马鱼Tyrosinase基因。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔恒宓，薛松磊，沈晖，孙振，欧阳娟，徐慧，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32