提取粪便DNA的方法及试剂盒技术

技术编号:19712054 阅读:181 留言:0更新日期:2018-12-08 18:14
本发明专利技术提出了提取粪便DNA的方法和用于提取粪便DNA的试剂盒。所述方法包括:将链霉亲合素包被的磁珠与生物素修饰的探针接触,以便获得磁珠‑探针复合物;对待测粪便进行预处理,以便获得预处理液;以及将所述预处理液与所述磁珠‑探针复合物接触,以便提取粪便DNA。利用本发明专利技术的方法提取粪便DNA至少具有下列优点的至少之一:特异性强、操作简便、粪便DNA得率高、纯度高和适于规模化应用。

【技术实现步骤摘要】
提取粪便DNA的方法及试剂盒
本专利技术涉及生物领域。具体地,本专利技术涉及提取粪便DNA的方法及试剂盒。
技术介绍
近年来兴起的多靶点粪便DNA检测因具有无创性、方便简单、准确性高等优点而成为临床诊断的研究热点之一,其基本原理是正常成人每天都会有上皮细胞脱落至肠腔并随粪便排出体外,而肠道肿瘤细胞由于生物学行为的改变、细胞不正常凋亡、新陈代谢加快等因素,比正常上皮细胞更易脱落。通过收集和检测粪便中肠道肿瘤细胞的异常DNA即可实现癌症的早期筛查。然而,目前提取粪便DNA的方法及试剂盒仍有待研究。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。需要说明的是,本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的:目前,粪便样本中宿主细胞DNA含量较少,且干扰物质种类及含量较多,如各种酶阻抑剂(粘液、细菌和食物残渣等)和胆盐等,导致从粪便里提取出的DNA量非常低或者提取出的DNA质量较低难以用于PCR扩增。而且,现有的粪便DNA提取方法大多操作繁琐、耗时,无法广泛应用。有鉴于此,专利技术人利用链霉亲合素包被的磁珠结合生物素修饰的探针特异性地捕获目标基因,同时起到了纯化和富集DNA的目的,提高了DNA提取率和纯度。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法至少具有下列优点的至少之一:特异性强、操作简便、粪便DNA得率高、纯度高和适于规模化应用。为此,在本专利技术的一个方面,本专利技术提出了一种提取粪便DNA的方法。根据本专利技术的实施例,所述方法包括:将链霉亲合素包被的磁珠与生物素修饰的探针接触,以便获得磁珠-探针复合物;对待测粪便进行预处理,以便获得预处理液;以及将所述预处理液与所述磁珠-探针复合物接触,以便提取粪便DNA。专利技术人利用链霉亲合素包被的磁珠结合生物素修饰的探针特异性地捕获目标基因,同时起到了纯化和富集DNA的目的,提高了DNA提取率和纯度。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法提取粪便DNA至少具有下列优点的至少之一:特异性强、操作简便、粪便DNA得率高、纯度高和适于规模化应用。根据本专利技术的实施例,所述提取粪便DNA的方法还可以具有下列附加技术特征:根据本专利技术的实施例,所述链霉亲合素包被的磁珠是以磁珠溶液的形式提供,所述生物素修饰的探针是以探针溶液的形式提供,所述磁珠-探针复合物中,所述磁珠浓度为80nM~120nM,所述探针浓度为10nM~15nM。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述链霉亲合素包被的磁珠与生物素修饰的探针的接触时间为1~2小时。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述磁珠-探针复合物是通过下列方式获得的:1)取含有链霉亲合素包被的磁珠溶液,于磁力架上静置,弃上清;2)向步骤1)所得到的磁珠中加入缓冲液清洗磁珠,混匀,进行磁力吸附,弃上清;3)向步骤2)所得到的磁珠中加入缓冲液,重悬所述磁珠,加入含有生物素修饰的探针溶液,室温孵育,以便获得所述磁珠-探针复合物。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的优选实施例,所述磁珠-探针复合物是通过下列方式获得的:1)取15μL链霉亲合素包被的磁珠溶液,于磁力架上静置4min,弃上清;2)向步骤1)所得到的磁珠中加入1mLBindingBuffer清洗磁珠,震荡,于磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次,其中,所述BindingBuffer包括:5mmol/LTris-Hcl、0.5mmol/LEDTA和1mol/LNaCL;3)向步骤2)所得到的磁珠中加入200μLBindingBuffer重悬磁珠,加入10μL生物素修饰的探针溶液,室温孵育1h;4)向步骤3)所得的混合液中加入1mLBindingBuffer,轻柔震荡,于磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次,洗去未结合的探针,加200μLBindingBuffer重悬磁珠-探针复合物,其中,所述磁珠浓度为98nM~119nM,所述探针浓度为14.5nM。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述待测粪便预先保存在保存液中,所述保存液中含有乙二胺四乙酸二钠、Tris、NaCl或无水乙醇。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述预处理所采用的试剂包括:交联聚乙烯吡咯烷酮、异硫氰酸胍溶液和蛋白酶K。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述预处理包括:将所述待测粪便与交联聚乙烯吡咯烷酮在室温下孵育,离心,收集上清液;将所述上清液、异硫氰酸胍溶液和蛋白酶K溶液在室温下孵育,以便获得混合液;以及将所述混合液进行孵育,结束后置于冰上冷却,以便获得所述预处理液,其中,所述交联聚乙烯吡咯烷酮的终浓度为30~60mg/mL,所述异硫氰酸胍溶液的终浓度为2~3mol/L,所述蛋白酶K的终浓度为70~120μg/mL。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的优选实施例,所述预处理包括:1)取5mL含有粪便的保存液,以60HZ的频率均质处理5min,于3200×g条件下离心6min,收集第一上清液;2)向所述第一上清液中加入交联聚乙烯吡咯烷酮,终浓度为50mg/mL,室温旋转孵育15min,3200×g条件下离心6min,收集第二上清液;3)向所述第二上清液中加入浓度为6mol/L的异硫氰酸胍溶液,终浓度为2.4mol/L,加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K,终浓度为90μg/mL,混匀后,室温孵育30min;以及4)将步骤3)所得混合液进行90℃金属浴10min,结束后于冰上冷却,以便获得所述预处理液。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述预处理液与所述磁珠-探针复合物接触是在室温下进行1~2小时。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的实施例,所述预处理液与所述磁珠-探针复合物接触后,进一步包括如下步骤:(1)将所述预处理液与所述磁珠-探针复合物接触后所得到的混合液进行磁力吸附,弃上清;(2)将步骤(1)所得到的磁珠中加入无酶水,孵育,结束后置于冰上冷却;(3)将步骤(2)所得到的磁珠进行磁力吸附,收集上清,以便提取粪便DNA。由此,根据本专利技术实施例的提取粪便DNA的方法进一步具有较高的特异性、较简便的操作、较高的粪便DNA得率或纯度。根据本专利技术的优选实施例,包括:(1)向所述预处理液中加入所述磁珠-探针复合物,室温孵育1~2h;(2)将步骤(1)所得到的混合液置于磁力架上静置吸附5~10min,弃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取粪便DNA的方法,其特征在于,包括:将链霉亲合素包被的磁珠与生物素修饰的探针接触,以便获得磁珠‑探针复合物;对待测粪便进行预处理,以便获得预处理液;以及将所述预处理液与所述磁珠‑探针复合物接触,以便提取粪便DNA。

【技术特征摘要】
1.一种提取粪便DNA的方法,其特征在于,包括:将链霉亲合素包被的磁珠与生物素修饰的探针接触,以便获得磁珠-探针复合物;对待测粪便进行预处理,以便获得预处理液;以及将所述预处理液与所述磁珠-探针复合物接触,以便提取粪便DNA。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磁珠-探针复合物中,所述磁珠浓度为80nM~120nM,所述探针浓度为10nM~15nM。3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述链霉亲合素包被的磁珠与生物素修饰的探针的接触时间为1~2小时。4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磁珠-探针复合物是通过下列方式获得的:1)取含有链霉亲合素包被的磁珠溶液,于磁力架上静置,弃上清;2)向步骤1)所得到的磁珠中加入缓冲液清洗磁珠,混匀,进行磁力吸附,弃上清;3)向步骤2)所得到的磁珠中加入缓冲液,重悬所述磁珠,加入含有生物素修饰的探针溶液,室温孵育,以便获得所述磁珠-探针复合物;优选地,所述磁珠-探针复合物是通过下列方式获得的:1)取15μL链霉亲合素包被的磁珠溶液,于磁力架上静置4min,弃上清;2)向步骤1)所得到的磁珠中加入1mLBindingBuffer清洗磁珠,震荡,于磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次,其中,所述BindingBuffer包括:5mmol/LTris-Hcl、0.5mmol/LEDTA和1mol/LNaCL;3)向步骤2)所得到的磁珠中加入200μLBindingBuffer重悬磁珠,加入10μL生物素修饰的探针溶液,室温孵育1h;4)向步骤3)所得的混合液中加入1mLBindingBuffer,轻柔震荡,于磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次,洗去未结合的探针,加200μLBindingBuffer重悬磁珠-探针复合物,其中,所述磁珠浓度为98nM~119nM,所述探针浓度为14.5nM。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述待测粪便预先保存在保存液中,所述保存液中含有乙二胺四乙酸二钠、Tris、NaCl或无水乙醇;任选地,所述预处理所采用的试剂包括:交联聚乙烯吡咯烷酮、异硫氰酸胍溶液和蛋白酶K。6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述预处理包括:将所述待测粪便与交联聚乙烯吡咯烷酮在室温下孵育,离心,收集上清液;将所述上清液、异硫氰酸胍溶液和蛋白酶K溶液在室温下孵育,以便获得混合液;...

【专利技术属性】
技术研发人员:潘瑞丽刘晶王云霞
申请(专利权)人:上海锐翌生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:上海,31

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