一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法技术

本发明专利技术提供一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，采用热变性法95℃10‑20分钟后，立即冰置5‑10分钟防止复性，然后将DNA在75℃进行转化45‑60分钟，并采用磁珠法以及含PEG6000/8000的结合液对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量的甲基化DNA，有利于甲基化检测的标准化及全自动化操作，用于后续粪便样本中人源DNA中基因的甲基化水平分析。

【技术实现步骤摘要】
一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法
本专利技术属于生物
，更具体的说，它涉及一种人粪便总DNA在恒温条件、变性剂及DNA保护试剂条件下，使用亚硫酸盐溶液转化DNA，并使用纯化试剂进行转化产物回收的方法。
技术介绍
甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化，本专利技术涉及的是DNA甲基化。DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)，其经DNA甲基转移酶催化，胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化是一种表观(epigenetic)遗传修饰，它在不改变DNA序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与细胞癌变、肿瘤的发生、发展有着密切的联系。DNA甲基化的分析方法有多种，如BSP、MSP等方法，但都需要提前将DNA进行亚硫酸盐转化后，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。目前市面上常见的亚硫酸盐转化试剂盒基本步骤分为：DNA氢氧化钠变性、亚硫酸盐变温转化及脱磺酸基、脱盐和洗脱。但是该类亚硫酸盐转化试剂盒存在的主要问题有：1)采用氢氧化钠将DNA变性，而后进行长时间的转化及变温过程，且需要氢氧化钠溶液进行脱磺酸基。在此过程中，会导致DNA严重降解及片段化；2)基本都是采用离心柱法进行产物纯化，部分试剂盒还需要carrierRNA，造成DNA损耗高、回收效率降低，且难以实现自动化操作；3)目前市面尚无专门针对人粪便DNA样本进行亚硫酸盐处理的试剂盒，而已有的商业化试剂盒对于人粪便DNA的亚硫酸盐处理的CT转化率和回收率比较低，对于人源DNA的后续甲基化分析产生较大影响。因此，基于目前表观遗传学的快速发展需求，以及现有亚硫酸盐转化及纯化方法的一些问题，本专利技术对变性、转化及纯化方法进行了优化改进。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决以上提出的问题，提供一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，对变性、转化及纯化方法进行了优化改进，采用热变性法95℃10-20分钟后，立即冰置5-10分钟防止复性，然后将DNA在75℃进行转化45-60分钟，并采用磁珠法以及含PEG6000/8000的结合液对转化DNA进行纯化，能够得到高转化率、高质量的bis-DNA(bis代表甲基化)，并有利于甲基化检测的标准化及全自动化操作，用于后续粪便样本中人源DNA中基因的甲基化水平分析。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术是一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，包括如下步骤：(1)在2.0mL离心管中加入1-3000ug的待处理人粪便总DNA(甲基化DNA或未甲基化DNA)，DNA浓度为10ng/μL时推荐用量为20-200μL；(2)在步骤(1)离心管中加入100-300μL亚硫酸盐转化溶液、30-50μL保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，瞬时离心；(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育10-20分钟；(4)立即将步骤(3)离心管取出，放置冰上5-10分钟；(5)将步骤(4)离心管从冰上取出，颠倒混匀，瞬时离心，将离心管置于恒温振荡孵育器中，75℃静置孵育45-60分钟；(6)瞬时离心步骤(5)反应后的离心管，向其中加入1000μL磁珠结合溶液、100-200μL混匀的磁珠溶液，涡旋混匀，其中，磁珠预先混匀且室温平衡至少30分钟；(7)将步骤(6)离心管置于23℃的恒温振荡孵育器中，转速1000rpm，孵育45-60分钟；(8)瞬时离心离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，待磁珠分离后，弃除上清液；(9)将步骤(8)离心管从磁力架上取下，加入800μL磁珠结合溶液；涡旋混匀重悬磁珠；重复(8)步骤；(10)将步骤(9)离心管从磁力架上取下，加入800μL洗涤液；涡旋混匀后重复(8)步骤；(11)将步骤(10)离心管从磁力架上取下，加入600μL洗涤液；涡旋混匀后重复(8)步骤；(12)瞬时离心后步骤(11)离心管，将其置于磁力架2-5分钟，去除残留液体；(13)打开步骤(12)离心管管盖，将离心管放置于恒温振荡孵育器中；23℃静置15分钟，等待磁珠干燥，静置时不要震荡；(14)向步骤(13)离心管加入35μL洗脱液；盖好离心管；涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡孵育器中，23℃，1000rpm，孵育10分钟；(15)瞬时离心步骤(14)离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，将洗脱液转移至新的无DNase无RNase酶的1.5mL离心管中；-80℃保存备用。作为优化，所述亚硫酸盐转化溶液为含40％-50％(m/v)亚硫酸氢钠和5％-15％(m/v)亚硫酸钠的水溶液，pH值为5.4-5.5。作为优化，所述保护溶液为按100-200mg：1.5mL比例配置的奎诺二甲基丙烯酸酯与二乙二醇二甲醚的混合液。作为优化，所述磁珠结合液为含0.1％-0.5％PEG6000(v/v)、0.1％-0.5％PEG8000(v/v)、5％-10％氯化钠(m/v)、5-10mMEDTA(pH8.0)、5-10mMTris-HCl(pH7.6)和体积浓度为50％无水乙醇的水溶液，pH7.5-7.6。作为优化，所述洗涤液为含体积浓度为70-80％乙醇的水溶液。作为优化，所述步骤(14)和(15)洗脱液为无核酸酶水或Tris缓冲液或TE缓冲液。作为优化，所述磁珠溶液为含浓度为50mg/mL纳米磁性颗粒的水溶液，所述纳米磁性颗粒为超顺四氧化三铁或超顺三氧化二铁颗粒，且外表由表面修饰有羟基或羧基的二氧化硅包被。本专利技术涉及的粪便样本DNA亚硫酸盐转化及纯化的方法，其可应用于脱氧核糖核酸转化及后续纯化，所纯化的转化后DNA可用于后续粪便样本人源DNA中相关基因甲基化的分析。本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术涉及的甲基化转化试剂，不同于现有的主流NaOH碱变性转化方法，而是恒温条件下的热变性转化，不会导致DNA的降解及片段化，整个转化时间不超过100分钟；所需仪器设备简单，操作简便。(2)本专利技术涉及的磁珠法适用于DNA甲基化转化处理后的纯化，涉及的磁珠结合液与磁珠匹配，增加转化后单链DNA与磁珠的结合能力。且不需要去磺化步骤，也不需要carrierRNA，操作更简便，节省整个实验操作时间。(3)本专利技术涉及的粪便样本DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法，所有环节均适用于自动化操作，可用于全流程标准化和自动化平台的搭建。(4)本专利技术涉及的粪便样本DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法，可实现高DNA负荷、高CT转化效率以及高回收效率。附图说明图1：本专利技术方法转化及纯化甲基化人粪便总DNA的实时荧光PCR检测；图2：Z品牌试剂盒转化及纯化甲基化人粪便总DNA的实时荧光PCR检测；图3：采用本专利技术方法与Z品牌商品化试剂盒方法分别转化及纯化甲基化人基因组DNA的实时荧光PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在2.0mL离心管中加入1‑3000ug的待处理人粪便总DNA；(2)在步骤(1)离心管中加入100‑300μL亚硫酸盐转化溶液、30‑50μL保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，瞬时离心；(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育10～20分钟；(4)立即将步骤(3)离心管取出，放置冰上5‑10分钟；(5)将步骤(4)离心管从冰上取出，颠倒混匀，瞬时离心，将离心管置于恒温振荡孵育器中，75℃静置孵育45‑60分钟；(6)瞬时离心步骤(5)反应后的离心管，向其中加入1000μL磁珠结合溶液、100‑200μL混匀的磁珠溶液，涡旋混匀，其中，磁珠预先混匀且室温平衡至少30分钟；(7)将步骤(6)离心管置于23℃的恒温振荡孵育器中，转速1000rpm，孵育45‑60分钟；(8)瞬时离心离心管后，将其置于磁力架2‑5分钟，待磁珠分离后，弃除上清液；(9)将步骤(8)离心管从磁力架上取下，加入800μL磁珠结合溶液；涡旋混匀重悬磁珠；重复步骤(8)；(10)将步骤(9)离心管从磁力架上取下，加入800μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；(11)将步骤(10)离心管从磁力架上取下，加入600μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；(12)瞬时离心步骤(11)离心管后，将其置于磁力架2‑5分钟，去除残留液体；(13)打开步骤(12)离心管的管盖，将离心管放置于恒温振荡孵育器中；23℃静置15分钟，等待磁珠干燥，静置时不要震荡；(14)向步骤(13)离心管加入35μL洗脱液；盖好离心管；涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡孵育器中，23℃，1000rpm，孵育10分钟；(15)瞬时离心步骤(14)离心管后，将其置于磁力架2‑5分钟，将洗脱液转移至新的无DNase无RNase酶的1.5mL离心管中；‑80℃保存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种人粪便总DNA亚硫酸盐转化及回收纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在2.0mL离心管中加入1-3000ug的待处理人粪便总DNA；(2)在步骤(1)离心管中加入100-300μL亚硫酸盐转化溶液、30-50μL保护溶液，盖紧离心管后，涡旋混匀，瞬时离心；(3)将步骤(2)离心管密闭置于恒温振荡孵育器中，95℃静置孵育10～20分钟；(4)立即将步骤(3)离心管取出，放置冰上5-10分钟；(5)将步骤(4)离心管从冰上取出，颠倒混匀，瞬时离心，将离心管置于恒温振荡孵育器中，75℃静置孵育45-60分钟；(6)瞬时离心步骤(5)反应后的离心管，向其中加入1000μL磁珠结合溶液、100-200μL混匀的磁珠溶液，涡旋混匀，其中，磁珠预先混匀且室温平衡至少30分钟；(7)将步骤(6)离心管置于23℃的恒温振荡孵育器中，转速1000rpm，孵育45-60分钟；(8)瞬时离心离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，待磁珠分离后，弃除上清液；(9)将步骤(8)离心管从磁力架上取下，加入800μL磁珠结合溶液；涡旋混匀重悬磁珠；重复步骤(8)；(10)将步骤(9)离心管从磁力架上取下，加入800μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；(11)将步骤(10)离心管从磁力架上取下，加入600μL洗涤液；涡旋混匀后重复步骤(8)；(12)瞬时离心步骤(11)离心管后，将其置于磁力架2-5分钟，去除残留液体；(13)打开步骤(12)离心管的管盖，将离心管放置于恒温振荡孵育器中；23℃静置15分钟，等待磁珠干燥，静置时不要震荡；(14)向步骤(13)离心管加入35μL洗脱液；盖好离心管；涡旋混匀重悬磁珠；将离心管放入恒温振荡...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军一，肖雯，王巍，刘杰，舒平，尚慧捷，高金龙，
申请(专利权)人：杭州和壹基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33