一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备制造技术

一种用于医学领域的淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，其特征在于，引用了B淋巴细胞刺激因子，增加了以B淋巴细胞刺激因子为诱导剂的骨髓细胞融合前培养步骤，以促使淋巴细胞系各期细胞的定向分化、增量和成熟，从而增加淋巴细胞系的融合率，而且B淋巴细胞刺激因子参与了骨髓细胞融合、杂交细胞筛选及其克隆化传代扩增的全程诱导，有利于各期淋巴细胞的分化，由此制备出能在体外无限扩增的由人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞融合而制成的淋系白血病融合基因检测质控参考株，经融合基因的验证，应用于淋巴细胞白血病融合基因检测的质量控制。

【技术实现步骤摘要】
一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备
本专利技术涉及医学领域一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，主要用于急、慢性淋巴细胞白血病融合基因检测方法的质量控制。
技术介绍
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，分为急性和慢性，前者又分为急性淋巴细胞性白血病(ALL，再分为L1、L2和L3)和急性髓性白血病(AML，再分为M1即急性极微分化型原始粒细胞白血病、M2即急性部分分化型原始粒细胞白血病、M3即急性早幼粒细胞白血病、M4即急性粒-单核细胞白血病及M5即急性单核细胞白血病等)，按造血系统可分为粒细胞系(粒系)白血病、淋巴细胞系(淋系)白血病等。白血病患者因某些染色体发生易位或重排而产生融合基因，如慢性粒细胞白血病(CML)由t(9；22)(q34；q11)易位形成的BCR-ABL(90％以上)融合基因、急性早幼粒细胞白血病(APL)由t(15；17)(q22；q22)染色体易位形成的PML-RARAα(95％以上)融合基因、急性髓系白血病(AML)最常见的AML1/ETO(41％)和PML-RARa(23％)融合基因、儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的EL/AML1(占46％)、E2A/PBX1(占20％)、BCR/ABLp190、BCR/ABLp210、MLL/AF4融合基因以及成人ALL患者由于t(9；22)易位而产生的M-bcr/abl和m-bcr/abl融合基因。总之如BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO、CBF-MYH11、MLLAF4、TEL-AML1、E2A-PBX1、STE-CAN、TLS-ERG1等都是白血病的常见融合基因，这些基因的检测对白血病的诊断、治疗和预后判断均有重要的作用。这些基因的检测可采用荧光原位杂交、免疫印迹、PCR(RT-PCR、RQ-PCR、多重逆转录PCR)、FCM、基因芯片技术及全基因组测序等方法。但有很多因素会影响其检测方法的准确性，Harismendy等报道，不同的NGS平台假阳性率高达7.8％，等报道，26％的所检测的基因突变得到不同的解读，11％的检测突变得到完全相反的解读。2016年FDA校准项目(precisionFDA)用基因测序公司的操作软件“阅读”同一份基因检测样本的DNA测序结果，几乎50％的阅读软件无法重复同样的结果。这就需要研制白血病融合基因检测的质量控制物质，以监测、校准检测系统，提高融合基因检测的准确性。但作为质控物，需在各个实验室与被检标本进行同时检测或预先用于检测方法的校准，需要反复试用，其用量很大，需要产业化制备的条件，所以首先要解决的是如何用有限的来自患者的而且是实验后剩余的骨髓细胞来制备各实验室反复试用的用量问题。申请人认为应该用细胞永生化的方法来解决这个问题。已知EB病毒转染法能解决B淋巴细胞的培养扩增，我们也曾采用EB病毒转染法建立易误诊染色体异常淋巴细胞系并用于淋巴细胞培养和染色体制备的质量控制，但申请人经反复试验，始终未能使EB病毒转染骨髓细胞而获得建系成功，可能是因为EB病毒仅能使成熟B淋巴细胞转化而不能使骨髓细胞转化。申请人发现Bodnar等曾报道用端粒酶催化亚单位(hTERT)转染人体组织细胞，实现了永生化，也发现猴肾病毒的大T抗原(SV40LT)能被用于多种细胞的永生化建株，但经申请人的试验均未使骨髓细胞永生化，申请人经多年的试验、研究和文献检索，终于从单克隆抗体的制备技术中受到启发，发现Kohler等曾于1975年将具有抗体产生基因的B淋巴细胞与具有无限扩增性能的骨髓瘤细胞在体外融合，得到兼具骨髓瘤细胞无限繁殖和B淋巴细胞分泌抗体的杂交瘤细胞株，其中来源于B淋巴细胞的抗体产生基因随着杂交瘤的繁殖而扩增，因被用于单克隆抗体的产业化制备而获诺贝尔奖。申请人受上述单克隆抗体制备方法的启发，拟将含融合基因但不能在体外无限生长的人源骨髓细胞与能在体外无限生长的鼠sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备同时植入两细胞全基因组、具有永生化特性的基因移植杂交株，使其中的融合基因随杂交株的无限生长而扩增，进而经杂交株的传代培养、克隆筛选、融合基因验证和克隆化扩增，制备已知融合基因且高度匹配于被测融合基因的人源性同源单克隆质控参考株，用于融合基因的产业化制备、相应融合基因检测的室内质控、室间质评、方法学验证及新方法的创建。但试验的结果又发现，含有目标融合基因的骨髓细胞融合率较低，所筛选到的含有目标融合基因的杂交细胞较少，所以申请人在骨髓细胞与sp2/0融合前增加了骨髓细胞预培养步骤，并在预培养、细胞融合、克隆筛选及克隆化传代的培养基中加入所需骨髓细胞(含目标融合基因)的分化刺激剂，从而增加了含有目标融合基因的骨髓细胞的融合率。
技术实现思路
为了解决长期困绕的无淋系白血病融合基因检测质控物的问题，本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备方法，另一目的是要提供一种淋系白血病融合基因检测的质控参考株。本专利技术的目的是这样实现的：以B淋巴细胞刺激因子(BLys或BAFF)为诱导剂，培养淋系白血病患者的骨髓细胞，以增加定向发育的淋系细胞，继之将经培养的人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞配成混合细胞，以聚乙二醇诱导细胞融合，并在细胞融合、HAT筛选、克隆化传代中均以含B淋巴细胞刺激因子的培养基，制备淋系白血病融合基因检测的质控参考株。较具体的说，以含25～35ng/mlB淋巴细胞刺激因子的骨髓细胞培养基培养含有多种造血干细胞但无法在体外无限传代的淋系白血病患者骨髓细胞24h～48h，然后将经培养的人骨髓细胞与能在体外无限传代的鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)以2∶1混合，在30％聚乙二醇融合剂(PEG1500)的作用下，使人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞融合为兼具两细胞成份和特性的杂交细胞，继之以含15～25ng/mlB淋巴细胞刺激因子、2×HAT和15％胎牛血清的DMEM培养基选择培养，以筛选杂交细胞克隆，然后分别挑取各克隆细胞进行分瓶扩大培养或在6孔板中进行分孔扩大培养，最后分别取适量的来自各克隆的扩增细胞，分别进行融合基因检测，鉴定出含有融合基因的杂交株克隆，进而扩增并制备淋系白血病融合基因检测的质控参考株。本专利技术根据已广泛应用但仅局限于单克隆抗体制备的鼠免疫B细胞与鼠骨髓瘤细胞融合的杂交瘤技术，设计了淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备方法。本专利技术曾试验了以未经培养及经培养的骨髓细胞分别以文献报道的EB病毒转染、猴肾病毒大T抗原基因(SV40LT)转染及端粒酶逆转录酶(hTERT)转染方法构建能在体外无限传代扩增的永生化骨髓淋巴细胞系，均未获得预期结果，而以未经培养及经培养的骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞进行直接融合，其融合率也达不到预期效果，所以本专利技术在反复试验及传统杂交瘤技术的基础上，引用了B淋巴细胞刺激因子，增加了以B淋巴细胞刺激因子为诱导剂的骨髓细胞融合前培养步骤，以促使B淋巴细胞系各期细胞的定向分化、增量和成熟，从而增加淋系的融合率，而且B淋巴细胞刺激因子参与了骨髓细胞融合、杂交细胞筛选及其克隆化传代扩增的全程诱导，有利于淋系各期细胞的分化，由此制备出能在体外无限扩增的淋系白血病融合基因检测质控参考株，经融合基因的验证，应用于淋巴细胞白血病融合基因检测的质量控制。具体实施方式图1是本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，其特征在于，引用了B淋巴细胞刺激因子，增加了以B淋巴细胞刺激因子为诱导剂的人骨髓细胞融合前培养步骤，而且B淋巴细胞刺激因子参与了细胞融合、融合细胞筛选及其培养的全程诱导，以促使各期淋巴细胞的分化、增量和成熟，从而增加淋巴细胞的融合率，由此制成能在体外通过无限扩增融合细胞而扩增融合基因的质控参考株。

【技术特征摘要】
1.一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，其特征在于，引用了B淋巴细胞刺激因子，增加了以B淋巴细胞刺激因子为诱导剂的人骨髓细胞融合前培养步骤，而且B淋巴细胞刺激因子参与了细胞融合、融合细胞筛选及其培养的全程诱导，以促使各期淋巴细胞的分化、增量和成熟，从而增加淋巴细胞的融合率，由此制成能在体外通过无限扩增融合细胞而扩增融合基因的质控参考株。2.根据权利要求1所述的一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，其特征在于，在人骨髓细胞融合前培养中，将B淋巴细胞刺激因子按25～35ng/ml的用量配入骨髓细胞培养基。3.根据权利要求1所述的一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，其特征在于，在细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，苏岚，袁武锋，杜雨轩，王薇，应俊，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江,33