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一种全基因组杂交克隆方法技术

技术编号:19712039 阅读:49 留言:0更新日期:2018-12-08 18:14
一种用于生物领域的全基因组杂交克隆方法,其特征在于,以鼠sp2/0细胞替换传统基因克隆中所用的基因载体及感受态细胞,将欲作全基因组克隆的细胞与能无限繁殖的sp2/0细胞混合,以0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液消化,然后经PEG作用,两亲代细胞依次发生胞膜、胞浆、胞核、染色体及基因组的融合杂交,经HAT筛选而获得既具有待克隆基因组又能无限繁殖的继承了两亲代细胞遗传物质的杂交细胞,即传统基因克隆中的感受态细胞,使杂交细胞中的全基因组随着杂交细胞的无限繁殖而克隆,解决了只能克隆短片段DNA而不能同步克隆细胞内全基因组的传统基因克隆技术所不能解决的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种全基因组杂交克隆方法
本专利技术公开了一种用于生物领域的全基因组杂交克隆方法,主要应用于细胞内全基因组的同步克隆扩增。
技术介绍
基因克隆是70年代专利技术的具有革命性的技术,基因克隆又称为DNA重组,是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外连接,构建重组DNA,然后导入受体细胞,进行目的基因阳性受体细胞的筛选和无性繁殖。基因克隆由P.Berg等专利技术创建,1972年P.Berg等把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后,再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来,构成一种新的重组DNA分子。1973年S.Cohen等把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来,构成了一个重组质粒,并将该重组质粒转入大肠杆菌中复制,第一次建立了完整的基因克隆体系。基因克隆从专利技术到现在经历了三个发展阶段,第一个阶段是至今仍被广泛应用的20世纪70年代初需要限制性内切酶和连接酶的经典基因克隆技术的创建。第二个阶段是20世纪90年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现,这种方法不需要连接酶的参与,不受限制性内切酶的限制,使得基因克隆更加灵活。第三个阶段是21世纪初重组酶被运用到基因克隆中,使基因克隆靶向性更强,操作更简便。基因克隆可概括为“分、切、连、转、选”步骤,最终目的是将目的基因导入宿主细胞,并在宿主细胞内大量复制。其中“分”是指分离制备合格的DNA,包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA,这些DNA分子或来自目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA分子;“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA或者切出目的基因,由于基因组DNA较大,不利于克隆,因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段,常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化,若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知,根据已知序列设计引物,从基因组DNA或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因;“连”是指用DNA连接酶将目的DNA和载体DNA连接起来,形成重组的DNA分子;“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增;“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。按基因克隆的操作步骤,需要进行①DNA或RNA提取;②DNA的PCR扩增或RNA的cDNA逆转录PCR扩增;③PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收;④回收的DNA以限制性片段长度内切酶酶切;⑤T4DNA连接酶连接经酶切的DNA和载体,构建重组DNA;⑥重组DNA转化感受态大肠杆菌,并进行阳性菌落筛选;⑦所筛选的阳性克隆的培养及PCR等检测鉴定。综上可知,传统的基因克隆技术存在以下问题:①涉及PCR仪等多种高档设备,对设备要求高;②涉及多种实验试剂,试剂成本高;③操作繁杂、技术要求高;④特别是只能克隆短片段的DNA,无法克隆较长片段的DNA分子,无法同步克隆细胞水平的全基因组。
技术实现思路
为了解决传统基因克隆技术所不能解决的问题,本专利技术人提出了本专利技术。本专利技术的目的是要提供一种全基因组杂交克隆方法。本专利技术的目的是这样实现的:以鼠骨髓瘤sp2/0细胞替换传统基因克隆中所用的基因载体及感受态细胞,将欲作全基因组克隆的细胞与能无限繁殖的sp2/0细胞以2~5∶1混合,以0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液消化30分钟,然后经30~50%PEG作用,两亲代细胞依次发生胞膜、胞浆、胞核、染色体及基因组的融合杂交,经HAT筛选,获得既具有待克隆基因组又能无限繁殖的继承了两亲代细胞遗传物质的杂交细胞,即传统基因克隆中的感受态细胞,使杂交细胞中的全基因组随着杂交细胞的无限繁殖而克隆。更进一步的说,根据待融合细胞的表面标志,在上述技术方案的基础上,其一是引用免疫球蛋白(Ig)作为促融合剂,使具有IgGFc受体的待作基因组克隆的细胞(B细胞)与具有IgGFab受体的sp2/0细胞被IgG连接为免疫复合物,再以PEG的作用或电融合法进行细胞融合杂交;其二是同时引用免疫球蛋白(Ig)和金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为促融合剂,使均具有IgGFab受体的待基因组克隆细胞和sp2/0细胞均被IgGFab结合,再被具有IgGFc受体的SPA连接为免疫复合物,进而以PEG的作用或电融合法进行细胞融合杂交。本专利技术创建的全基因组克隆方法,解决了传统基因克隆技术所不能解决的问题,克服了只能克隆短片段DNA而不能同步克隆细胞内全基因组的传统基因克隆的缺点,并且本专利技术较传统基因克隆方法操作简便、成本低,因为本专利技术是通过细胞杂交将待克隆的全基因组导入杂交细胞进行克隆,所以无需传统基因克隆中用于DNA重组以将DNA导入宿主细胞的载体,从而也无需载体的构建、载体的费用、载体与DNA连接操作及其所用的内切酶、T4DNA连接酶、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等实验步骤及所需的器材,又因为本专利技术是通过杂交细胞的无限繁殖而克隆其胞内的全基因组,所以无需传统基因克隆中将重组DNA导入感受态宿主细胞内复制的步骤,从而也无需传统的感受态宿主细胞、无需将重组DNA导入宿主细胞的操作及其阳性宿主细胞的筛选、鉴定等实验步骤和实验器材,而且本专利技术以0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液消化待基因克隆细胞和sp2/0细胞,有利于细胞融合,经实验证实本专利技术能同步克隆细胞内多个突变基因,对于全基因组的克隆及生物产业的应用具有极其重要的意义。具体实施方式图1是本专利技术的IgG促融合示意图。图2是本专利技术的SPA协同双抗体促融合示意图。图3是本专利技术的实拍细胞融合图。图4是本专利技术的杂交细胞的DNA电泳图。在图1中,1表示具有IgGFab受体的sp2/0细胞,2表示单克隆IgG,3表示具有IgGFc受体的待基因组克隆细胞,通过单克隆抗体将待杂交的细胞连接在一起,有利于细胞融合。在图2中,1表示具有IgGFc受体的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA),2表示编号为6和7的待基因组克隆细胞的单克隆抗体,3表示编号为4和5的待基因组克隆细胞的单克隆抗体,在单克隆抗体[2]与编号为6和7的待基因组克隆细胞结合、单克隆抗体[3]与编号为4和5的待基因组克隆细胞结合后,再经SPA的连接,编号为4、5、6和7的细胞均有利于融合。在图3中,在单克隆抗体和/或SPA的促融合下,经HAT筛选2周,在倒置显微镜下拍摄(40X),得到杂交瘤细胞克隆。在图4中,1为Mark,代表不同分子量的DNA在电泳图中所处的不同位置;2、3和4分别代表正常对照的E47、E49和E50基因在电泳图中的DNA条带;5、6和7分别代表DMD患者的E47、E49和E50基因在电泳图中可能出现的DNA条带,其中仅有E47基因在电泳图中出现DNA条带而E49和E50基因均无DNA条带;8、9和10分别代表sp2/0细胞的E47、E49和E50基因在电泳图中可能出现的DNA条带,其中仅有E49基因在电泳图中出现DNA浅带而E47和E50基因均无DNA条带;11、12和13分别代表DMD细胞和sp2/0融合后的杂交细胞的E47、E49和ES0基因在电泳图中可能出现的DNA条带,其中的E47基因在电泳图中出现来自于DMD的DNA条带,E49基因在电泳图中出现来自于sp2/0的DNA浅本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种全基因组杂交克隆方法,其特征在于,以能在体外无限繁殖的鼠sp2/0细胞替换传统基因克隆的基因载体和感受态细胞,通过细胞融合将待克隆基因导入sp2/0细胞,使之与sp2/0细胞的DNA和/或RNA杂交并随sp2/0细胞的无限繁殖而克隆,解决了只能克隆短片段DNA而不能同步克隆细胞内全基因组的传统基因克隆技术所不能解决的问题。

【技术特征摘要】
1.一种全基因组杂交克隆方法,其特征在于,以能在体外无限繁殖的鼠sp2/0细胞替换传统基因克隆的基因载体和感受态细胞,通过细胞融合将待克隆基因导入sp2/0细胞,使之与sp2/0细胞的DNA和/或RNA杂交并随sp2/0细胞的无限繁殖而克隆,解决了只能克隆短片段DNA而不能同步克隆细胞内全基因组的传统基因克隆技术所不能解决的问题。2.根据权利要求1所述的一种全基因组杂交克隆方法,其特征在于,所述细胞融合将含待克隆基因的细胞和sp2/0细胞在融合前以0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化30分钟。3.根据权利要求1所述的一种全基因组杂交克...

【专利技术属性】
技术研发人员:翁炳焕
申请(专利权)人:翁炳焕
类型:发明
国别省市:浙江,33

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