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一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用技术

技术编号:19712029 阅读:68 留言:0更新日期:2018-12-08 18:13
本发明专利技术公开了一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用。该制备方法包括:将海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐混合,得到混合溶液;将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞。本发明专利技术制得的固定化细胞因具有磁性而为其在分离和连续发酵提供了便利,磁性材料上负载的离子液体大大提升了固定化细胞的催化活性。

【技术实现步骤摘要】
一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物固定化细胞
,尤其涉及一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
离子液体(Ionicliquids,ILs)是指由阴阳离子构成在室温下呈液体的有机熔盐。作为一种新型绿色介质,离子液体迫于国际社会对绿色清洁生产、环境保护、循环经济的强烈愿望以及离子液体自身的科学探索价值和巨大的应用潜力。离子液体在生物催化应用的报道逐年增加,呈现出良好的发展势头,离子液体作为共溶剂与许多酶、基质结合的生物转化过程已成为一个重要的研究课题。文献(李扬,曹红,李春,郑兰,张馨.不同阴离子组成的离子液体对产紫青霉生长、代谢及催化特性的影响[J].高等学校化学学报,2014,35(5):1057-1062.DOI:10.7503/cjcu20130859)以甘草酸(Glycyrrhizin,GL)生物转化为更高效、更安全的单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinicacidmonoglucuronide,GAMG)为目的,分别在几种含不同离子液体的介质中初步进行了PenicilliumpurpurogenumLi-3全细胞生物转化GL生成GAMG的研究。结果表明,在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)/缓冲液两相体系中,GAMG的产率比在纯缓冲液中高出了2倍多。由此可以看出,选择适当的离子液体作为催化介质可以提高PenicilliumpurpurogenumLi-3菌株全细胞催化效率。研究还表明,以离子液体为催化介质,有利于维持细胞的完整性,改善细胞膜的通透性,加速传质作用,促进营养物质进入细胞内,提高营养物质利用率;离子液体进入细胞还可以作用于胞内酶的活性位点,提高酶的催化活性。然而,离子液体作为生物催化介质价格昂贵、使用量大以及回收困难而导致使用成本高的问题一直是其应用于生物催化领域亟待解决的难题。游离的微生物细胞在生物转化过程中存在着细胞重复利用率低、需菌量大、倒罐易染菌、对培养环境敏感等缺点。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。固定化细胞技术具有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强、微生物流失少、产物分离容易、处理设备小型化等优点。磁性纳米粒子是很好的生物材料,在有机相合成的磁性纳米粒子表面常被表面活性剂包覆,为提高磁性纳米粒子水溶性和生物相容性,其表面需要进一步的功能化,以便进一步偶联生物活性基团,适当的表面修饰或表面功能化可以改善磁性纳米粒子与其他材料的相容性,以赋予其特殊的功能。纳米四氧化三铁(Fe3O4)具有超顺磁性,在磁场作用下能定向移动,通过给Fe3O4纳米粒子表面包覆不同的活性物质,制备出具有生物相容性的表面功能化的磁性复合材料,在许多领域得到了广泛的研究。壳聚糖(CS)是甲壳素脱乙酰化反应生成的一种线性聚合物,具有无毒副作用、良好的生物相容性及生物可降解性,其分子链上大量的氨基和羟基可以通过化学修饰而增添新的功能,接连上具有生物活性的物质在生物医学领域具有较好的研究前景。可将Fe3O4纳米粒子表面包覆CS进行磁性纳米粒子表面功能化,利用壳聚糖的生物性能和Fe3O4纳米粒子的靶向性,形成Fe3O4/CS纳米复合材料,不仅具有磁响应功能,还具有生物可降解性和与生物活性物质反应的特殊功能基团。许多研究已验证了Fe3O4/CS纳米复合材料具有优秀的生物相容性,应用于生物固定化技术可提高酶的热稳定性、保持酶活力,并能够更加有利于酶或细胞快速在线分离与连续化操作。在上述前期工作的基础上,若将Fe3O4/CS和离子液体应用到细胞固定化技术中,不仅能进一步促进细胞的催化活性,还能大大减少了离子液体的使用量,并且有利于离子液体的循环使用,对于离子液体使用成本高、使用量大和难于回收利用的问题便迎刃而解。
技术实现思路
本专利技术提供了一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法及其应用,制得的固定化细胞因具有磁性而为其在分离和连续发酵提供了便利,磁性材料上负载的离子液体大大提升了固定化细胞的催化活性。具体技术方案如下:一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法,包括:(1)将海藻酸钠(简称SA)、Fe3O4/CS磁性材料(简称Fe3O4/CS)和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(简称[BMIM]PF6)混合,得到混合溶液;(2)将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;(3)以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞。本专利技术利用滴加海藻酸钠(SA)到氯化钙溶液中的方法,由Ca2+向SA液滴内扩散形成实心的凝胶微球,[BMIM]PF6被包埋在凝胶微球中,菌体细胞和Fe3O4/CS则被固载在凝胶微球内部,三者均匀分散,相互接触。本专利技术所述的磁性微球是指包埋Fe3O4/CS磁性材料但不负载[BMIM]PF6的微球,也称为磁性不负载[BMIM]PF6微球。不加入[BMIM]PF6的磁性微球表面凹凸不平整,当微球结构中加入[BMIM]PF6后,微球整体表面部分凸起增多,随着[BMIM]PF6加入的越多,这种凸起结构也随之增加,[BMIM]PF6在固定化微球表面形成大量孔隙,提高了微球的传质性能,更有利于底物的传入和产物排出,并且[BMIM]PF6的催化作用提高了固定化细胞的生物活性。Fe3O4/CS磁性材料采用共沉淀法进行制备,具体制备方法如下:将壳聚糖缓冲液与含Fe2+和Fe3+的盐溶液混合后,在氮气保护下,慢慢滴入NaOH溶液中,滴完后55℃反应1小时,磁性分离、清洗、烘干,得到Fe3O4/CS磁性材料。作为优选,所述混合溶液中,海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的重量比为1:0.3~1:2~10;更优选,重量比为1:0.6:6;在该重量比下,固定化细胞的机械强度和催化活性表现为最佳。作为优选,海藻酸钠浓度为10~30g.L-1,Fe3O4/CS浓度为3~20g.L-1,[BMIM]PF6的浓度为41~205g.L-1;进一步优选,SA的浓度为20g.L-1,Fe3O4/CS浓度为13g.L-1,[BMIM]PF6的浓度为123g.L-1。本专利技术中,如未作特殊说明,所述[BMIM]PF6的纯度均大于99%。作为优选,所述的细胞为产紫青霉。更优选,所述的细胞为产紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3)。产紫青霉(PenicilliumpurpurogenumLi-3)的保藏号为CGMCCNo.446。作为优选,所述PenicilliumpurpurogenumLi-3的细胞悬液的浓度为4~6g.L-1;并以2.5~3.5mL菌悬液/100mL混悬液的比例,将菌悬液与混合溶液混合。采用对数生长期的PenicilliumpurpurogenumLi-3制备菌悬液,以保证细胞的活力。步骤(3)中,所述混悬液逐滴滴入氯化钙溶液中,实现对混悬液的固定化处理。作为优选,所述混悬液液滴的体积为45~50μL/滴。若混悬液液滴过大,则液滴在重力的作用下,容易造成拖尾现象,使得微球形状不规则、体积过大,在振摇状态下培养时会本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法,其特征在于,包括:(1)将海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1‑丁基‑3‑甲基咪唑六氟磷酸盐混合,得到混合溶液;(2)将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;(3)以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞。

【技术特征摘要】
1.一种磁性负载离子液体微球固定化细胞的制备方法,其特征在于,包括:(1)将海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐混合,得到混合溶液;(2)将所述混合溶液与细胞悬液进行混合,得到混悬液;(3)以CaCl2为交联剂,将所述混悬液进行固定化处理,得到磁性负载离子液体微球固定化细胞。2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)的混合溶液中,所述海藻酸钠、Fe3O4/CS磁性材料和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的质量比为1:0.3~1:2~10。3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)的混合溶液中,所述海藻酸钠的浓度为10~30g/L,所述Fe3O4/CS磁性材料的浓度为3~20g/L,所述1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为41~2...

【专利技术属性】
技术研发人员:曹红黄晓林金宏杰
申请(专利权)人:嘉兴学院
类型:发明
国别省市:浙江,33

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