一种高选择性头孢拉定合成酶突变体及其编码基因制造技术

本发明专利技术公开了一种高选择性头孢拉定合成酶突变体及其编码基因。本发明专利技术提供了如下蛋白质：将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸，β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的蛋白质。本发明专利技术所提供的蛋白质具更高的合成头孢拉定的活性和Vs/Vh以及更低的α，为酶法合成头孢拉定的工业化奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高选择性头孢拉定合成酶突变体及其编码基因
本专利技术属于生物化学领域，涉及一种高选择性头孢拉定合成酶突变体及其编码基因，特别涉及大肠杆菌青霉素G酰化酶组合突变体、编码基因及其在合成头孢拉定中的应用。
技术介绍
半合成β-内酰胺类抗生素是医药行业中使用最广泛的抗生素，每年产量达3万吨，年销售额超过150亿美元，占整个抗生素市场的65％，其中头孢菌素类占比约2/3。与此同时，用于合成β-内酰胺类抗生素及β-内酰胺母核的青霉素G酰化酶的用量也高达1000～3000万吨。(H,M,GrulichM,etal.CurrentstateandperspectivesofpenicillinGacylase-basedbiocatalyses.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2014,98(7):2867-2879)头孢拉定是美国施贵宝制药公司于1972年研究成功的第一代半合成头孢类抗生素，1977年首次在日本上市，也称先锋霉素VI，因其临床使用中的具有很多优点在我国占据很大市场。头孢拉定的合成方法包括化学法和酶法。目前工业生产中多采用化学法，尤其是混合酸酐法来制备头孢拉定。化学法生产头孢拉定的过程中存在着活化、缩合、基团保护与去保护等多个步骤，合成过程繁琐，反应条件苛刻，产生大量三废。酶法合成头孢拉定则工艺简单，反应条件温和，生产周期短，并且绿色环保。(芮菊，张体磊.酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展.中国药学会学术年会暨中国药师周.2008:348-348)酶法合成头孢拉定如图1所示。目前报道的青霉素G酰化酶及其突变体合成头孢拉定的收率不够高，酶法未能工业化。但随着环保要求越来越高，开发高质量的头孢拉定合成酶显得尤为重要和迫切。目前酶法合成头孢拉定的工艺主要是，利用固定的青霉素G酰化酶及其突变体催化二氢苯甘氨酸甲酯(2,5-dihydrophenylglycinemethylester,DHME)与7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodesacetoxycephalosporanicacid,7-ADCA)缩合生成头孢拉定(Cephradine)和甲醇。(YEShu-xiang,XUCheng-miao,WANGJia-bing.SynthesisofCephradinewiththeImmobilizedPenicillinAcylase.ChineseJournalofPharmaceuticals,2007,38:619-620)上述反应是动力学控制的过程，除合成反应外，还有头孢拉定水解和DHME水解两个反应，如图2所示。在动力学控制的合成反应中，有两个参数非常重要。第一个参数是Vs/Vh，即初始合成水解比，反映的是在一定反应条件下，酶对合成与水解反应的倾向性。Vs/Vh越大越好，越大说明越有利于合成头孢拉定，反之则倾向于水解生成二氢苯甘氨酸(2,5-dihydrophenylglycine,DHPG)。另外一个参数是α，为酶催化水解头孢拉定的催化效率(kcat/Km)cephradine与水解DHME的催化效率(kcat/Km)DHME之比。α越小越好，α越小表明酶越不容易水解产物头孢拉定，从而有利于头孢拉定的积累，否则合成得到的头孢拉定又很快水解掉，导致头孢拉定的总收率低。工业化要求Vs/Vh大于10，α小于0.1，这样有利于底物7-ADCA和DHME尽可能地转化成头孢拉定，减少水解产物的生成。(WynandB.L.Alkema,Anne-JanDijkhuis,ErikdeVriesandDickB.Janssen.Theroleofhydrophobicactive-siteresiduesinsubstratespecificityandacyltransferactivityofpenicillinacylase.EuropeanJournalofBiochemistry,2002,269:2093–2100)天然青霉素G酰化酶水解与合成头孢拉定的活性较高，但合成头孢拉定的Vs/Vh很低，而α很高。虽然目前有关酶法合成β-内酰胺类抗生素的报道较多，但研究主要集中在氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢羟氨苄以及头孢克洛等几种抗生素上。(H,M,GrulichM,KyslíkP.CurrentstateandperspectivesofpenicillinGacylase-basedbiocatalyses.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2014,98:2867–2879)利用青霉素G酰化酶及其突变体合成头孢拉定的相关报道较少。目前有专利WO98/20120报道了利用青霉素G酰化酶单点突变体F24βA合成头孢拉定时，在相同反应条件下其Vs/Vh比野生型酶高，此外专利201710451848.X报道了基于F24βA的两点突变体F24βA/S67βA及三点突变体F24βA/M142αL/S67βA在Vs/Vh得到进一步提高，但并没有基于相关突变实现酶法合成头孢拉定的工业化报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是在大肠杆菌天然青霉素G酰化酶、单点突变F24βA、两点突变体F24βA/S67βA及三点突变体F24βA/M142αL/S67βA基础上，提高合成头孢拉定Vs/Vh与降低α的组合突变。本专利技术首先要求保护如下蛋白质：将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸，β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的蛋白质。进一步，所述蛋白质为如下(a)或(b)：(a)由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质(命名为PGA_M3)；(b)将SEQIDNo.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有合成头孢拉定能力的由(a)衍生的蛋白质。其中，SEQIDNo.2所示的蛋白PGA_M3有846个氨基酸残基，第1～26位为信号肽，第27～235位为PGA_M3的α链、第236-289位为连接肽、第290-846位为PGA_M3的β链。蛋白质PGA_M3的具体示意图如图3所示。为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表：标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL编码所述蛋白质的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。在本专利技术的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下任一所示的DNA分子：1)SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白质，为将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸，β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，为将大肠杆菌天然青霉素G酰化酶的α链的第142位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸，β链的第24位苯丙氨酸替换为丙氨酸，β链的第67位丝氨酸替换为丙氨酸后得到的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下(a)或(b)：(a)由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将SEQIDNo.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有合成头孢拉定能力的由(a)衍生的蛋白质。3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1或2所述蛋白质的基因，所述基因为如下任一所示的DNA分子：1)SEQIDNo.1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码权利要求1或2所述蛋白质的DNA分子。5.含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。6.权利要求1或2所述的蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱玉山，何金文，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11