一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法技术

本申请属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法。该方法包括菌种活化、种子培养、发酵制备碱性蛋白酶等步骤。其中发酵制备碱性蛋白酶所采用的发酵培养基中含有：玉米淀粉或可溶性淀粉1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%。本申请中，通过对发酵工艺及发酵培养基进行优化，尤其是在发酵后期通过补充特定营养糖和氮源等营养成分，较好提高了发酵活力。测定结果表明，本申请通过工艺优化后，发酵活力可达5.8万U/mL以上，远高于现有的3.5万U/mL的发酵水平，表现出较好的提升效果。

【技术实现步骤摘要】
一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法
本申请属于微生物发酵工程
，具体涉及一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法。
技术介绍
碱性蛋白酶（AlkalineProtease）是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类，广泛存在于动、植物及微生物生物体中，在猪的胰脏中最早被发现。研究表明，碱性蛋白酶大都属于丝氨酸蛋白酶，酶活性中心含有丝氨酸，等电点pI值多数在8.0左右，其分子量一般在15-40kDa。碱性蛋白酶作为一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、皮革、洗涤剂、酿造等行业，其最大用途是作为添加剂生产加酶洗涤剂。而食品方面的应用主要用于蛋白类食品的发酵、肉类嫩化、酒精澄清等。由于用途及应用范围十分广泛，因此产业内每年对碱性蛋白酶的需求量都很大，并呈持续增长趋势，为此，如何持续提高碱性蛋白酶的发酵活力及提高碱性蛋白酶产量是业内迫切需要关注和解决的技术问题。
技术实现思路
本申请目的在于提供一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，从而为碱性蛋白酶的生产、应用奠定基础。本申请所采取的技术方案详述如下。一种提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，该方法具体包括如下生产步骤：（1）菌种活化以地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）作为发酵菌株，首先将低温冰箱中保存的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）原种接种到LB平板培养基上，37℃恒温培养24小时以进行菌种复苏，然后将活化后地衣芽孢杆菌接入斜面培养基，好氧条件下35~38℃培养28~36h以进行活化菌株；所述斜面培养基，为固态，质量百分含量计，具体组成为：蛋白胨0.4%，牛肉膏0.2%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.6%，pH自然；所述地衣芽孢杆菌发酵菌株具体例如采用中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏号为CICC10266的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）菌株；（2）种子培养将步骤（1）中复苏、活化后菌种接入种子培养基中（质量比例计，接种量0.5~2%），35~38℃恒温、180~250r/min转速摇床培养28~37h，以此作为种子液；所述种子培养基，为液态，以质量百分比计，培养基中含有：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠1%、葡萄糖2%；将种子液按1~3%的体积比例接种入含有灭菌后一级种子培养基的发酵罐中，35~38℃、210~270r/min（优选37℃、180r/min）发酵培养20~30h，以此作为一级种子液；所述一级种子培养基，以质量百分含量计，培养基组成为：葡萄糖0.5%，玉米淀粉2%，棉仁蛋白粉1.2%，磷酸二氢钾0.2%，pH自然；发酵过程中，发酵罐压保持在0.05~0.08Mpa，发酵液与通气量比（V/V▪min）为1：0.45~0.8（优选1：0.6）；发酵结束后，应进行镜检，确保无杂菌感染；（3）发酵制备碱性蛋白酶将步骤（2）中所制备一级种子液按3~8%的体积比例接种入发酵培养基，35~38℃、180~210r/min（优选37℃、180r/min）发酵培养20~30h；再补充补料培养基，同样条件下继续发酵培养20~24h；优选方式为，先在发酵培养基中发酵培养24h，补充补料培养基后，再发酵培养24h（即发酵培养至48h）；发酵过程中，发酵罐压保持在0.05~0.08Mpa，发酵液与通气量比（V/V▪min）为1：0.45~0.8（优选1：0.6）；所述发酵培养基，为液态，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：玉米淀粉（或可溶性淀粉）1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%，余量为水；进一步优化配方为：玉米淀粉2~3%、棉仁蛋白粉1~2%、磷酸氢二钠0.15~0.25%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%；具体的较佳配方为：玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.025%；所述补料培养基，为玉米糖浆和棉仁蛋白粉的混合物，以质量比计算，玉米糖浆：棉仁蛋白粉=5~8：2~3；或者说，补充补料培养基时，以质量比例计，玉米糖浆的用量为补充前发酵液总质量的5~8%，棉仁蛋白粉用量为补充前发酵液总质量的2~3%；发酵结束后所得即为含有碱性蛋白酶的发酵液，进一步按现有技术进行过滤、提纯等操作即可制备碱性蛋白酶成品。本申请中，通过对发酵工艺及发酵培养基进行优化，尤其是在发酵后期通过补充特定营养糖和氮源等营养成分，较好提高了发酵活力。测定结果表明，本申请通过工艺优化后，发酵活力可达5.8万U/mL以上，远高于现有的已报道3.5万U/mL的发酵水平（孙同毅等，高产碱性蛋白酶菌株HAP26选育，氨基酸和生物资源，2007年02期），表现出较好的提升效果，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。附图说明图1为不同碳源形式对产酶的影响；图2为玉米淀粉用量对发酵产酶的影响；图3为棉仁蛋白用量对产酶影响；图4为磷酸氢二钠用量对产酶影响；图5为磷酸二氢钾用量对产酶的影响；图6为氯化钙用量对产酶的影响。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。物料情况：玉米淀粉（水分≤14%）：黑龙江乾朗生物科技有限公司生产；可溶性淀粉（水分≤14%）：诸城兴茂玉米开发有限公司生产；棉仁蛋白粉（蛋白含量≥49.9%）：兴化市兴农棉仁蛋白加工厂生产；玉米糖浆（DE值＞60%）：孟州金玉米公司产品；磷酸氢二钠（Na2HPO4≥98%）：苏州蓝翔化工科技有限公司产品；磷酸二氢钾（KH2PO4≥98%）：武汉无机盐公司产品；氯化钙（CaCl2≥95%）：潍坊海滨化工有限公司产品；发酵菌株：下述实施例中所采用的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：CICC10266，为一种可公开获得的工业生产用菌株。实施例以地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CICC10266菌株为例，就本申请所提供提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法简要介绍如下。（一）菌种活化首先将低温冰箱中保存的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）原种接种到LB平板培养基上，37℃恒温培养24小时以进行菌种复苏，然后将活化后地衣芽孢杆菌接入斜面培养基，好氧条件下37℃培养36h以进行活化菌株；所述斜面培养基，为固态，质量百分含量计，具体组成为：蛋白胨0.4%，牛肉膏0.2%，磷酸二氢钾0.3%，琼脂1.6%，pH自然。（二）种子培养将步骤（1）中复苏、活化后菌种接入种子培养基中（质量比例计，接种量1%），37℃、220r/min转速摇床培养36h，以此作为种子液；所述种子培养基，为液态，以质量百分比计，培养基中含有：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、氯化钠1%、葡萄糖2%；将种子液按2%的体积比例接种入含有灭菌后（121~123℃实消40~45分钟后，培养基降温至38℃左右再进行接种）一级种子培养基的发酵罐中，37℃、180r/min发酵培养24h，以此作为一级种子液；所述一级种子培养基，以质量百分含量计，培养基组成为：葡萄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碱性蛋白酶制备用发酵培养基，其特征在于，该培养基用于地衣芽孢杆菌发酵制备碱性蛋白酶用；所述发酵培养基，为液态，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：玉米淀粉或可溶性淀粉1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%。

【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶制备用发酵培养基，其特征在于，该培养基用于地衣芽孢杆菌发酵制备碱性蛋白酶用；所述发酵培养基，为液态，以质量百分含量计，发酵培养基中含有：玉米淀粉或可溶性淀粉1.5~3.5%、棉仁蛋白粉0.5~2.5%、磷酸氢二钠0.1~0.3%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%。2.如权利要求1所述碱性蛋白酶制备用发酵培养基，其特征在于，玉米淀粉2~3%、棉仁蛋白粉1~2%、磷酸氢二钠0.15~0.25%、磷酸二氢钾0.1~0.2%、氯化钙0.02~0.03%。3.如权利要求2所述碱性蛋白酶制备用发酵培养基，其特征在于，玉米淀粉2.5%、棉仁蛋白粉1.5%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钾0.15%、氯化钙0.025%。4.利用权利要求1~3任一项所述发酵培养基的提高碱性蛋白酶发酵活力的生产方法，其特征在于，该方法具体包括如下生产步骤：（1）菌种活化以地衣芽孢杆菌作为发酵菌株，首先将地衣芽孢杆菌进行菌种复苏，然后将进行活化菌株；（2）种子培养将步骤（1）中复苏、活化后菌种接入种子培养基中，35~38℃恒温、180~250r/min转速摇床培养28~37h，以此作为种子液；将种子液接种入含有灭菌后一级种子培养基的发酵罐中，35~38℃、210~270r/min发酵培养20~30h，以此作为一级种子液；发酵过程中，发酵罐压保持在0.05~0.08Mpa，发酵液与通气量比（V/V▪min）为1：0.45~0.8；（3）发酵制备碱性蛋白酶将步骤（2...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙利鹏，焦国宝，管宁，陈晓宇，
申请(专利权)人：河南新仰韶生物微生态有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41