一种重组变构胶原酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及重组变构胶原酶的纯化方法及其应用，公开了一种制备高纯度单一突变体胶原蛋白酶ColH的方法和所获得的产品。所述制备高纯度单一突变体胶原蛋白酶ColH的方法包括采用特定宿主菌BL21(DE3)表达E451D单点突变ColH变构胶原酶蛋白，经低温菌种发酵诱导后，提高目的蛋白产量。通过五步纯化：Capto Phenyl HS疏水层析；Capto Q阴离子交换层析；CaptoOctyl疏水层析；Phenyl HP疏水层析；Source 15Q阴离子交换层析后，获得了纯度98％以上的目的蛋白。生物学实验结果表明，此工艺生产的突变胶原蛋白酶纯度高，稳定性好，与之前的胶原蛋白酶商品相比具有明显的优势，酶比活显著提高。

【技术实现步骤摘要】
一种重组变构胶原酶的制备方法及其应用
本专利技术属于生物制品制药
，涉及重组变构胶原酶的纯化方法及其应用。
技术介绍
胶原蛋白酶无论在医疗健康、生产实践及科研方面都有着广泛的应用，比如医学上用于清创、治疗腰椎间盘突出、治疗罕见病如杜普伊特伦挛缩与佩罗尼氏症等，并有望开发出溶脂、除疤、皮肤微整形的新药，生产上用于食品软化等，科研实验方面用于细胞分离、考古样本的处理等。随着人们生活水平的日益提高，肥胖人群越来越常见，对爱美的人士来说肥胖是个大问题。目前减肥市场产品很多，脂肪抽吸术是一种应用较多的减脂方法。脂肪抽吸是一种借助仪器的物理方法，对身体有一定的损伤，抽吸部位的其他组织很容易损伤，也容易发生感染、瘀伤、血肿、深静脉血栓等副作用。目前，市场上还有激光辅助溶脂、超声辅助溶脂和注射溶脂等有创溶脂，还有冷冻溶脂、射频、超声等无创溶脂。局部皮下脂肪团，例如双下巴，是一种比较常见的脂肪堆积现象，这种局部皮下脂肪团难以用运动进行消除。2015年，美国FDA批准了全球首个“双下巴”溶脂针Kybella(ATX-101)，用于中度至重度“双下巴”成人，该针剂是用于消除多余颏下脂肪(双下巴)的首个也是唯一一个非手术治疗产品。Kybella是人工合成的脱氧胆酸，其主要作用于细胞膜，而使细胞破裂，进而实现溶脂效果。由于脱氧胆酸的作用机理，Kybella的作用没有特异性，除脂肪细胞外，也能作用于其他细胞，因此有较大副作用，容易造成下颌缘神经损伤、咽下困难、注射部位血肿/瘀伤等。随着胶原酶的发现和应用，其特殊的作用机制使得其能应用于溶脂领域。当前商业化的胶原蛋白酶(包括来自溶组织梭状芽胞杆菌的胶原蛋白酶)都是直接从生物样本中分离提取的，由于胶原酶在生物体中存在多种同工酶，这些商业化的品种往往是由5-6种胶原蛋白酶组成的混合物。即使经过高度纯化，具有相似的分子量和等电点(PIs)的ColH和ColG也是很难进行分离的。因此，来自溶组织梭状芽胞杆菌的高度纯化的胶原蛋白酶仍然是包含ColG和ColH的混合物。2015年上市的Xiaflex就是ColH和ColG两种胶原酶的混合物，而且纯度较低。由于成分的非单一性，实际应用方面存在较多限制，比如在动物注射时容易引起出血，副作用不易把控。EijiTamai等的研究(EijiTamai等，High-levelexpressionofhis-taggedclostridialcollagenaseinClostridiumperfringen，ApplMicrobiolBiotechnol(2008)80:627–635)用产气荚膜梭菌分泌表达胶原酶ColH，为了便于纯化，ColH的C端带HIS标签。经过硫酸铵沉淀、锌柱亲和纯化、MonoQ阴离子交换层析等步骤得到纯度约90％的重组ColH。PaulinaDucka等的研究(PaulinaDucka等，Auniversalstrategyforhigh-yieldproductionofsolubleandfunctionalclostridialcollagenasesinE.coli，ApplMicrobiolBiotechnol(2009)83:1055–1065)用大肠杆菌表达ColH，经镍柱亲和纯化、阴离子交换层析、分子筛层析得到纯度约90％的重组ColH。这些研究得到的ColH纯度及质量控制都难以达到临床应用要求。纯化自商业来源的胶原蛋白酶(包括来自溶组织梭状芽胞杆菌的)是由5-6种胶原蛋白酶组成的混合物。即使经过高度纯化，具有相似的分子量和等电点(PIs)的ColH和ColG也是很难进行分离的。因此，来自溶组织梭状芽胞杆菌的高度纯化版本的胶原蛋白酶仍然包括ColG和ColH的混合物。在我们进行的肥胖大鼠实验中，通过常规过程纯化的野生型胶原蛋白酶诱导了大量出血。CN101678088公开了一种重组变构胶原酶在溶脂方面的应用，该变构酶序列含有GST标签，并在CoIH(Glu451Asp)前附加有肽基序，经镍柱亲和层析纯化得到纯度约为90％的蛋白产品，但在实际应用过程中发现该产品难以制药产业化，不能进入市场。主要存在以下两个问题：(1)蛋白纯度较低。蛋白纯化一直是影响蛋白药物产业化的难点问题，蛋白药物杂质来源包括a.工艺相关杂质如宿主细胞成分、内毒素等；b.下游工序产生的杂质如蛋白溶解剂、还原剂、变性剂、微量金属、纯化色谱配体等；c.产品相关杂质如前体、错误折叠蛋白、产品片段及某些降解产物等。杂质因具有潜在的健康危险性(致癌性、过敏性、抗原性、一般或特殊毒性)，因此对于治疗性蛋白药物的纯度一般要求大于95％以上。(2)产品包含GST标签，属于非天然序列。亲和层析是目前常用的蛋白分离纯化手段，GST是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白质可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但蛋白质上的GST必须能合适地折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；并且，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白质的可溶性，使其形成包涵体，这会破坏蛋白质的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题(欧芹，林雪松主编,生物化学与分子生物学实验教程第2版,北京大学医学出版社，2015.08，第18页)。
技术实现思路
本专利技术涉及一种组合物，包括一种高纯度单一突变体胶原蛋白酶ColH(编号：RJV001)。天然胶原酶由于活性较高，对胶原的降解较剧烈，容易引起副作用。而且，天然胶原酶是一种混合酶，不利于CMC(化学品生产控制)，每一批次的产品各组分比例难以一致，对后续应用于人体产生一定的风险。为了得到能产业化的胶原酶ColH，本专利技术将溶组织梭菌中表达胶原蛋白酶ColH经E451D单点突变后，降低催化活性，使其作用于动物组织时相对温和，更有利于开发新药，有希望用于更多的适应症。具体地，变构ColH的比活约是天然胶原酶的10％，Km值与天然胶原酶相比变化不大，但Kcat值明显降低。(Km值为米氏常数，是衡量酶与底物亲和力的。Kcat又叫转化数，利用Vmax除以酶浓度进行计算。所以可以知道，Kcat衡量的是在最优条件下酶催化生成底物的速率。Kcat是一个常数，其单位是1/s，也可以将Kcat理解成单个酶分子在一秒内转化底物的数量，或者单个酶分子转换一个底物分子所需的时间。)因此，变构ColH相对于天然ColH具有更温和的催化作用，能够缓慢剪切胶原蛋白。另外，在得到了高纯度(98％以上)的变构胶原酶后，对变构胶原酶的稳定性进行了检测，发现变构胶原酶的稳定性更好。本专利技术涉及的组合物可以进一步包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体，包括对突变体ColH呈惰性的载体，例如那些选生理盐水、葡聚糖水溶液和羟乙基淀粉水溶液所组成的组，优选适合缓冲至中性pH。另外还可以使用纤维蛋白胶作为载体，其包括纤维蛋白或纤维蛋白前体，例如纤维蛋白原加凝血酶等。另一方面，本专利技术开发了一种利用重组大肠杆菌生产高纯度梭菌胶原蛋白酶的工艺方法。通过摸索发酵条件和优化培养基，使目的蛋白在大肠杆菌中表达后大部分可溶，并且发酵周期较短，胶原蛋白酶产量较高，催化活性稳定；菌体收获后经高压匀浆破碎，经中空纤维柱过滤澄清、5步柱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，包含纯度98％以上重组变构胶原酶，其中所述重组变构胶原酶为溶组织梭菌中表达胶原蛋白酶ColH的451位点谷氨酸被突变成天冬氨酸，所述重组变构胶原酶的序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种组合物，包含纯度98％以上重组变构胶原酶，其中所述重组变构胶原酶为溶组织梭菌中表达胶原蛋白酶ColH的451位点谷氨酸被突变成天冬氨酸，所述重组变构胶原酶的序列如SEQIDNO：1所示。2.一种制备纯度98％以上重组变构胶原酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，所述重组变构胶原酶的序列如SEQIDNO：1所示：(1)重组变构胶原酶菌种构建，其中所述重组变构胶原酶为溶组织梭菌中表达胶原蛋白酶ColH的451位点谷氨酸被突变成天冬氨酸；(2)重组变构胶原酶菌种发酵；(3)CaptoPhenylHS疏水层析：平衡CaptoPhenylHS疏水层析柱，将菌体破碎上清经过硫酸铵沉淀重悬后上样，洗脱液进行洗脱，收集洗脱峰，得到收集液；(4)CaptoQ阴离子交换层析：平衡CaptoQ阴离子交换层析柱，将步骤(3)得到的收集液上样，洗脱，收集主峰，得到收集液；(5)CaptoOctyl疏水层析：平衡CaptoOctyl疏水层析柱，将步骤(4)得到的收集液上样，洗脱，收集主峰，得到收集液；(6)PhenylHP疏水层析：平衡PhenylHP疏水层析柱，将步骤(5)得到的收集液经过高...

【专利技术属性】
技术研发人员：仓勇，张震，杜刚，陈福鼎，
申请(专利权)人：杭州观苏生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33