表达磷脂酶D的重组菌株及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种磷脂酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还涉及一种编码磷脂酶D的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了一种通过系统改造表达元件提高磷脂酶D表达水平的方法，该方法包括对信号肽、核糖体结合位点以及启动子的筛选与替换，构建的重组质粒转化至宿主菌中，重组菌株可成功表达磷脂酶D。本发明专利技术的磷脂酶D具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L‑丝氨酸为底物合成产物磷脂酰丝氨酸。重组菌酶活稳定性较好，发酵周期短，为大规模工业化生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
表达磷脂酶D的重组菌株及应用
本专利技术涉及一种生物
，尤其涉及一种表达磷脂酶D的重组菌株及应用。
技术介绍
磷脂酰丝氨酸是一种调节膜蛋白功能状态的磷脂，在动植物组织中均有发现，已被用作食品添加剂以预防老年痴呆。因为它在改善记忆，预防肌肉疼痛，治疗抑郁症等方面都有积极作用，磷脂酰丝氨酸近年来受到了广泛关注。通常情况下，人们可从动植物组织中通过提取分离的方法获得磷脂酰丝氨酸，也可以利用一系列的化学反应合成磷脂酰丝氨酸。但是由于动物细胞和植物组织中磷脂酰丝氨酸含量少，且分离提取过程会造成磷脂酰丝氨酸的损失，导致最终获得的磷脂酰丝氨酸得率较低；且化学合成磷脂酰丝氨酸需要经过一系列复杂的化学反应，过程繁琐且污染环境。由磷脂酶D(PLD)介导的磷脂酰基转移反应是一种有效合成磷脂酰丝氨酸的方法。由于其转化率高，反应条件温和，绿色环保等优点，目前通过酶法合成磷脂酰丝氨酸正逐步得到重视。磷脂酶D(EC3.1.4.4)广泛存在于多种生物体中，包括哺乳动物、植物、酵母和细菌中。磷脂酶D目前已成为合成和修饰磷脂的重要工具。由磷脂酶D合成的一些稀有磷脂已成为商业化的实验室试剂，磷脂酰丝氨酸由于其已知的多种功能已作为食品添加剂销售。最近，有人提出，各种结构和功能相关的磷脂酶D构成了磷脂酶D超家族，该超家族包括哺乳动物，植物和细菌磷脂酶D。超家族成员具有如下共同的特征：两个高度保守的序列，HxKxxxxD(x代表任意氨基酸残基；定义为HKD模体)，它们被认为是磷脂酶D的活性中心。来自链霉菌属的Streptomycessp.PMFPLD(PMF-PLD)的三级结构已被解析，这是第一个已知三级结构的磷脂酶D序列，其催化机理也被进一步研究。催化通过两步(乒乓机制)反应进行。首先，第一个HKD基序上的组氨酸亲核攻击磷脂酰胆碱上的P-O键，形成磷脂酰基酶中间体。然后，第二个HKD上的组氨酸激活进入的受体醇，被激活的受体醇攻击过渡态中间物形成产物磷脂酰丝氨酸(ChinaOils&Fats.2016,41,80-84)。目前已有研究报道了磷脂酶D的异源表达，最常用的宿主是大肠杆菌Escherichiacoli。Zambonelli等人将来自于链霉菌属的磷脂酶D基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysE中表达，通过IPTG诱导测定其酶活性约为0.005U/mL(EnzymeandMicrobialTechnology.2003,33,676-688)。在食品工业中，枯草芽孢杆菌被认为是安全的(GRAS)表达宿主，并且具有高效胞外分泌系统，蛋白表达至胞外可大大简化下游纯化加工过程。Lu等人在枯草芽孢杆菌DB104中表达来自大肠杆菌K12的磷脂酶D编码基因，重组磷脂酶D活性为1.50U/mL(ChinaBiotechnology.2008,28,56-60)。谷氨酸棒杆菌是一种单细胞膜革兰氏阳性菌，同样被认定为GRAS的菌株，由于其靶蛋白的分泌效率，分泌蛋白的产量和稳定性以及低的胞外水解酶活性，目前已成为表达外源蛋白质的优质宿主。目前国内外关于磷脂酶D的研究多处于对菌株分离筛选、磷脂酶D的分离纯化以及理化性质的研究阶段，在分子生物学方面，相关基因的克隆与表达研究还相对较少。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种表达磷脂酶D的重组菌株及应用，本专利技术通过信号肽、RBS和启动子改造来实现磷脂酶D的高效分泌表达，提供包含本专利技术基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞，以及利用重组菌株生产磷脂酰丝氨酸的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种磷脂酶D，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述磷脂酶D的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三个目的是提供包含SEQIDNO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。本专利技术的第四个目的是提供一种表达磷脂酶D的重组质粒，包括SEQIDNO.2所示的基因序列、使磷脂酶D胞外表达的信号肽基因、用于表达磷脂酶D的核糖体结合位点、用于表达磷脂酶D的启动子，其中，信号肽基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步地，构建上述重组质粒所用的出发质粒为pDXW-10a，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术一具体实施例中，重组质粒pDXW-wrpld4的构建方法包括以下步骤：(1)以含有磷脂酶D编码基因的质粒为模板，利用引物PCR扩增磷脂酶D编码基因；以B.subtilis168基因组为模板，利用携带有RBS的引物PCR扩增信号肽序列，利用融合PCR技术将含有RBS的信号肽序列和磷脂酶D编码基因序列融合；以B.subtilis168基因组为模板，设计引物，扩增启动子序列；(2)将pDXW-10多克隆位点上的KpnI酶切位点GGTACC突变为GGAACC，并在tac-M启动子前设计KpnI酶切位点，得到pDXW-10a质粒；(3)将步骤(1)得到的扩增产物克隆至pDXW-10a质粒中构建重组质粒。本专利技术通过信号肽、RBS和启动子改造来实现磷脂酶D的高效分泌表达。本专利技术的第五个目的是提供一种表达磷脂酶D的重组菌株，重组菌株中导入上述表达磷脂酶D的重组质粒。进一步地，重组质粒的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、毕赤酵母Pichiapastoris或谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum。进一步地，表达磷脂酶D的重组菌株的构建方法包括以下步骤：将表达磷脂酶D的重组质粒电转化入宿主菌，然后于含卡那霉素抗性的固体种子培养基中，在20-60℃(优选为25-35℃)下培养培养0.5-5天(优选为2-4天)至转化子长出，筛选出阳性转化子，然后将阳性转化子接种至含卡那霉素抗性的液体种子培养基中培养至OD562值为10-40(优选为20-30)。本专利技术的第六个目的是公开上述重组菌株在生产磷脂酰丝氨酸中的应用。本专利技术的第七个目的是提供一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：利用上述生产磷脂酶D的重组菌株所产生的生产磷脂酶D催化底物大豆卵磷脂和丝氨酸的反应，在30-70℃条件下反应2-30h，得到磷脂酰丝氨酸。进一步地，反应在Ca2+存在的条件下进行。进一步地，Ca2+的浓度为0.5-40mM(优选为10-20mM，更优选为15mM)。进一步地，大豆卵磷脂和丝氨酸的浓度比为1:1-1:8(优选为1:4-1:6，更优选为1:5)。进一步地，反应在有机-水相的混合体系中进行，有机相和水相体积比为4:1-4:4。进一步地，有机相为正己烷、乙酸乙酯、氯仿、乙醚和甲苯中的一种或几种。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术提供了一种新的磷脂酶D，同时提供了一种通过系统改造表达元件提高磷脂酶D表达水平的方法，构建了表达磷脂酶D的重组表达载体、重组菌株，同时提供了一种新的生产磷脂酰丝氨酸的方法。本专利技术所构建的重组菌株表现出磷脂酶D活性，可成功表达磷脂酶D，酶活达到1.9U/mL，相较于未改造的出发菌株，酶活提高了7.6倍。本专利技术的磷脂酶D具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L-丝氨酸为底物合成产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种磷脂酶D，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种磷脂酶D，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的磷脂酶D的基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.包含SEQIDNO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。4.一种表达磷脂酶D的重组质粒，其特征在于：包括权利要求2所述的基因序列、使磷脂酶D胞外表达的信号肽基因、用于表达磷脂酶D的核糖体结合位点、用于表达磷脂酶D的启动子，其中，信号肽基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。5.根据权利要求4所述的表达磷脂酶D的重组质粒，其特征在于：所用出发质粒为pDXW-10a，其核苷酸序列如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，许正宏，龚劲松，侯海娟，张晓梅，李恒，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32