一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。本发明专利技术易错DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，得到易错DNA聚合酶基因序列SEQ ID NO：1；(2)克隆SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；(3)将核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21中，获得表达菌株；(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16‑20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术提高了易错DNA聚合酶表达和纯化效率，以获得稳定、高活力的易错DNA聚合酶，提高易错效果。

【技术实现步骤摘要】
一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。
技术介绍
PCR是一种DNA片段体外复制技术，但常有一定的碱基错配发生，一般错配率为10-6～10-5。碱基错配虽然降低了DNA序列复制的保真性，但对获得新DNA序列提供了一种可利用的突破口。易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的碱基错配率，从而获得与原来不同的DNA序列或基因。易错PCR作为一种简便、有效地获得DNA序列变异的技术，主要是针对特定的基因，这在遗传和基因改良研究中具有巨大的应用前景。易错PCR技术是采用多种方法提高DNA聚合酶的碱基错配率，并稳定非互补碱基对。改变PCR反应条件的方法主要有4种，一是使用低保真度Taq酶、并加大Taq酶用量；二是调整反应体系中4种dNTP的浓度，使之非1∶1∶1∶1的平衡浓度关系；三是在反应体系中加入一定量的Mn2+；四是增加反应体系中的Mg2+浓度。此外，降低起始模板浓度、增加每个循环的延伸时间、提高反应体系pH值、增加循环次数等也都可以明显提高诱变率。几种方法可单独使用，但更多的时候是综合使用，以求最简单、快捷的得到更多的突变子。以上的易错PCR研究全部采用改变PCR反应条件，来提高DNA聚合酶错误率的方法进行，但易错PCR产量和变异水平偏低。较低的模板浓度以及引物与模板结合严格性的降低，使得目标片段的产量偏低由于碱基变异偏好、转换高于颠换，造成变异谱较窄，筛库得到有益基因的概率降低。三是对模板的要求较高，最好是只含目的基因的DNA片段。另外，应用易错PCR时一般都要针对具体基因进行诱变条件的优化，需要优化的条件有多个，包括Mn2+浓度、Mg2+浓度、4种dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度、延伸时间、循环次数等，这些条件综合起来优化还比较费力。为了解决这些问题，有人尝试通过修饰DNA聚合酶来提高常规PCR错配率的研究。Benjamin和Connolly于2004年报道了一个PfuDNA聚合酶的变种在易错PCR反应中表现出极好的性能。PfuDNA聚合酶有两个螺旋构成了聚合酶的指状子域，这一区域负责将碱基与模板链正确地互补配对。当两个螺旋之间的关键氨基酸发生变异，与缺失3'-5'核酸外切酶活性同时发生时，一个高保真野生型聚合酶就变为了一个低保真聚合酶。这个PfuDNA聚合酶变种能够在标准PCR反应条件下用于诱变基因，并得到高频率、几乎没有任何倾向的变异。
技术实现思路
为了解决易错PCR时操作的繁琐及条件的优化，本专利技术提供一种编码易错DNA聚合酶及其制备方法。该方法可以得到高纯度易错DNA聚合酶。本专利技术是为实现上述技术目的而采取的技术方案为：一种编码易错DNA聚合酶，所述编码易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，基因序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术易错DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，得到易错DNA聚合酶基因序列SEQIDNO：1；(2)克隆SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；(3)将步骤(2)所得的核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21中，获得表达菌株；(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，37℃培养4.5h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术步骤(1)中所述的提取红球菌基因组DNA的方法为：采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA；所述的比对方法为：经华大基因测序，注释，通过blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全场为3252bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，编码1123个核苷酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术步骤(4)中所述的表达菌株得具体获得方法为：通过PCR进行易错DNA聚合酶基因的扩增，扩增引物为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物和pET32a质粒进行EcoRI和NotI双酶切，之后电泳，回收，将目的片段易错DNA聚合酶基因和pET32a进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒为pET32a-errorTaq，将质粒转化入感受态E.coliBL21中，获得表达菌株。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术步骤(5)中所述裂解菌体是采用溶菌酶裂解。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术在步骤(5)中，所述纯化是热变性和镍柱亲和层析。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述溶菌酶裂解时采用的溶菌酶浓度为0.2-0.44mg/mL。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述层析柱为镍柱亲和层析。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述热变性为裂解菌体采用溶菌酶裂解后，上清液80℃加热30分钟；离心，所得上清液进行镍柱亲和层析。本专利技术是在已构建的重组易错DNA聚合酶基因表达载体的基础上，进行表达体系的优化，提高易错DNA聚合酶表达和纯化效率，以获得稳定、高活力的易错DNA聚合酶，提高易错效果。本专利技术通过测序、基因克隆，从红球菌中克隆到一个易错DNA聚合酶基因，通过制备重组易错DNA聚合酶的方法，重组菌株诱导表达制备出高活力易错DNA聚合酶，酶活力达到2IU/μl，通过易错PCR，证实其易错效果要优于目前所使用的方法。附图说明图1为本专利技术纯化的易错DNA聚合酶蛋白电泳图；图2为本专利技术制备的易错DNA聚合酶进行易错PCR；图3为本专利技术PCR扩增模板gene1的DNA片段。具体实施方式实施例1：基因全长编码区的测序，克隆：采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA，经华大基因测序，通过blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全场为3252bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，编码1123个核苷酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。通过PCR进行易错DNA聚合酶基因的扩增，扩增引物为SEQIDNO：3:GCGAATTCATGCAGTCGATCGTGCAGTT,SEQIDNO：4AGCGGCCGCGCGAAAGTCGCGTGAT，PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，回收产物和pET32a质粒进行EcoRI和NotI双酶切，之后电泳，回收。将目的片段易错DNA聚合酶基因和pET32a进行连接，16℃过夜，构建好的重组质粒为pET32a-errorTaq.将质粒转化入感受态E.coliBL21中，获得表达菌株。实施例2：重组易错DNA聚合酶菌株的培养及诱导将表达菌株接种于4mLLB液体培养基中(Amp100g/mL)37℃培养16-20h，之后取1.25mL培养液接种于250mL摇瓶中，37℃培养4.5h。之后加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，继续培养16-20h。实施例3：易错DNA聚合酶的提取4℃，12000rpm离心10本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码易错DNA聚合酶，其特征在于，所述编码易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种编码易错DNA聚合酶，其特征在于，所述编码易错DNA聚合酶氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，基因序列如SEQIDNO：2所示。2.权利要求1所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取红球菌基因组DNA，测序，比对，获得易错DNA聚合酶基因序列SEQIDNO：1；(2)克隆SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，得到核苷酸片段；(3)将步骤(2)所得的核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒；(4)将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞E.coliBL21中，获得表达菌株；(5)利用LB液体培养基培养表达菌株，37℃培养4.5h后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20h，裂解菌体，纯化，获得重组易错DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。3.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的提取红球菌基因组DNA的方法为：采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒提取红球菌R04总DNA；所述的比对方法为：经华大基因测序，注释，通过blast比对得到易错DNA聚合酶序列，该序列全场为3252bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，编码1123个核苷酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。4.根据权利要求2所述的易错DNA聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘承芸，杨秀清，
申请(专利权)人：山西医科大学，山西大学，
类型：发明
国别省市：山西,14