用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途技术

技术编号:19711862 阅读:46 留言:0更新日期:2018-12-08 18:10
本发明专利技术公开了一种用于检测二价汞离子的生物工程菌,所述生物工程菌含有表达载体merR op‑ompA‑rfp‑pSB1A2,其中,merR op‑ompA‑rfp为重组基因,pSB1A2为质粒骨架。本发明专利技术还公开了一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法和用途。本发明专利技术提供的生物工程菌可以高选择性、高灵敏性的识别并检测水环境中的目标金属离子汞,对0.025μM低浓度金属离子Hg

【技术实现步骤摘要】
用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途
本专利技术涉及水污染检测
更具体地说,本专利技术涉及一种用于检测二价汞离子的生物工程菌及其制备方法和用途。
技术介绍
在重金属污染研究中,密度在5.0g/mL以上的金属离子Hg2+是生物毒性显著的污染物之一。一旦污染进入水环境、土壤、生物体内,则会造成难以去除的局面。资料显示,极低浓度Hg2+也会对人类健康造成毒害,出现一系列人体消化道、肾、脏等损坏,更是危害中枢神经系统而引发汞中毒。近年来,生产工艺大量排放汞残液,致使重金属汞污染呈上升趋势。重金属汞污染不易降解,又抑制人体蛋白、酶等生命大分子物质的生物活性从而影响正常代谢。鉴于汞污染对环境和人体生命健康的严重危害,对水环境中Hg2+检测尤其重要。最初的化学试剂法,检测灵敏度和区分度有局限,无法特异性识别某一重金属离子,并且所选有机试剂释放环境引起二次污染。近代以来,汞检测的技术手段及研究方法的不断发展和改进。具备灵敏性极好的分析方法就有原子荧光光谱法(AtomicFluorescenceSpectrometry,AFS)、原子吸收光谱法(AtmoticAbsorptionSpectrometry,AAS)、原子发射光谱法(AtomicEmissionpectrometry,AES)和电感耦合等离子体质谱法(IductivelyCoupledPlasma-MassSpectrometry,ICP-MS)等。但这些依赖于大型仪器的检测方法成本高昂、样品处理复杂、所需时间长,难以实现低成本的、简单、快速的检测。。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种通过利用MerR蛋白对目标金属离子Hg2+高选择性、高灵敏性的识别及结合特性以及红色荧光蛋白mFRP1优异的荧光光谱性质,实现对水污染体系中痕量Hg2+特异性的可视化检测的生物工程菌。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点,提供了一种所述生物工程菌含有表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2,其中,merRop-ompA-rfp为重组基因,pSB1A2为质粒骨架。本专利技术还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,包括以下步骤:步骤一、利用PCR扩增反应分别实现merRop、ompA、rfp基因片段的扩增,将扩增后的merRop基因片段和ompA基因片段通过重叠延伸PCR技术连接,并通过PCR扩增反应实现扩增,得到目的基因片段merRop-ompA;步骤二、使用限制性内切酶XbaI和SpeI对pSB1A2质粒骨架和目的基因片段merRop-ompA进行双酶切,使目的基因片段merRop-ompA和pSB1A2质粒骨架同时露出相同的粘性末端,通过T4DNA连接酶将目的基因片段merRop-ompA和pSB1A2质粒骨架连接,实现merRop-ompA-pSB1A2质粒的构建;步骤三、使用限制性内切酶SpeI对merRop-ompA-pSB1A2质粒和扩增后的rfp基因片段进行单酶切,再用T4DNA连接酶将merRop-ompA-pSB1A2质粒和扩增后的rfp基因片段连接,完成表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2的构建;步骤四、通过化学转化法将表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2转化至感受态细胞内,获得所述生物工程菌。优选的是,步骤一中的目的基因片段merRop-ompA具体通过以下方法获得:分别以全合成的merRop、ompA、rfp基因序列为模板,进行第一次PCR扩增反应,再将扩增后的merRop和ompA基因片段末端的互补片段通过重叠延伸PCR技术实现merRop和ompA的连接,得到连接片段merRop-ompA,进行第二次PCR扩增反应,实现连接片段merRop-ompA的扩增,得到目的基因片段merRop-ompA。优选的是,步骤四中的感受态细胞为E.coliDH5α感受态细胞。优选的是,第一次PCR扩增反应时,merRop需要加入的引物包括ImeR-OPXF、OP-ompAUP,ompA需要加入的引物包括OP-ompADN、OmpASR,rfp需要加入的引物包括mRFP1SF、mRFP1SR;第二次PCR扩增反应加入的引物包括IMerR-OPXF和OmpASR。优选的是,步骤二中进行双酶切时的反应温度为37℃,反应时间为1h。优选的是,步骤三中进行单酶切时的反应温度为37℃,反应时间为1h。优选的是,第一次PCR扩增反应包括30个循环,其中,一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸5s;第二次PCR扩增反应包括30个循环,其中,一个循环依次包括98℃变性10s、55℃退火10s、72℃延伸10s。本专利技术还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的用途,该生物工程菌用于检测水环境是否含有Hg2+。优选的是,该生物工程菌识别Hg2+的反应时间为15min以上。本专利技术至少包括以下有益效果:本专利技术提供的生物工程菌可以高选择性的识别并检测水环境中的目标金属离子汞,对0.025μM金属离子Hg2+已经有明显的响应,而对高浓度的其它金属离子Ag+、Au3+、Cd2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Zn2+均没有响应。而且,在一定浓度(1μM)下,分析不同反应时间中工程菌响应程度,在15min相对短时间内,出现明显荧光强度,随着反应时间(15min~8h)变化,荧光强度增加。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术所述的pSB1A2质粒骨架的质粒图谱;图2为本专利技术所述的表达载体的构建流程图;图3为本专利技术所述的merRop、ompA、rfp、merRop-ompA基因片段扩增后的电泳图;图4为本专利技术所述的merRop-ompA-pSB1A2质粒及酶切鉴定的电泳图;图5为本专利技术所述的merRop-ompA-rfp-pSB1A2表达载体及酶切鉴定的电泳图;图6为本专利技术所述的生物工程菌对不同浓度Hg2+可视化检测的荧光强度图;图7为本专利技术所述的生物工程菌在不同培养时间中对相同浓度Hg2+可视化检测的荧光强度图;图8为本专利技术所述的生物工程菌对10种金属离子可视化检测的荧光强度图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是,下述实施方案中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。本专利技术提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌,所述生物工程菌含有表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2,其中,merRop-ompA-rfp为重组基因,pSB1A2为质粒骨架。pSB1A2质粒骨架用于构建重组质粒,pSB1A2质粒图谱如图1所示。如图2所示,本专利技术还提供一种用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,包括以下步骤:步骤一、利用PCR扩增反应分别实现merRop、ompA、rfp基因片段的扩增,将扩增后的merRop基因片段和ompA基因片段通过重叠延伸PCR技术连接,并通过PCR扩增反应实现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测二价汞离子的生物工程菌,其特征在于,所述生物工程菌含有表达载体merR op‑ompA‑rfp‑pSB1A2,其中,merR op‑ompA‑rfp为重组基因,pSB1A2为质粒骨架。

【技术特征摘要】
1.用于检测二价汞离子的生物工程菌,其特征在于,所述生物工程菌含有表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2,其中,merRop-ompA-rfp为重组基因,pSB1A2为质粒骨架。2.如权利要求1所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、利用PCR扩增反应分别实现merRop、ompA、rfp基因片段的扩增,将扩增后的merRop基因片段和ompA基因片段通过重叠延伸PCR技术连接,并通过PCR扩增反应实现扩增,得到目的基因片段merRop-ompA;步骤二、使用限制性内切酶XbaI和SpeI对pSB1A2质粒骨架和目的基因片段merRop-ompA进行双酶切,使目的基因片段merRop-ompA和pSB1A2质粒骨架同时露出相同的粘性末端,通过T4DNA连接酶将目的基因片段merRop-ompA和pSB1A2质粒骨架连接,实现merRop-ompA-pSB1A2质粒的构建;步骤三、使用限制性内切酶SpeI对merRop-ompA-pSB1A2质粒和扩增后的rfp基因片段进行单酶切,再用T4DNA连接酶将merRop-ompA-pSB1A2质粒和扩增后的rfp基因片段连接,完成表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2的构建;步骤四、通过化学转化法将表达载体merRop-ompA-rfp-pSB1A2转化至感受态细胞内,获得所述生物工程菌。3.如权利要求2所述的用于检测二价汞离子的生物工程菌的制备方法,其特征在于,步骤一中的目的基因片段merRop-ompA具体通过以下方法获得:分别以全合成的merRop、ompA、rfp基因序列为模板,进行第一次PCR扩增反应,再将扩增后的merRop和ompA基因片段末端的...

【专利技术属性】
技术研发人员:王丹郑亚楠金楠皓韦娜庞婷刘婷梁乐桂包晓萍
申请(专利权)人:广西师范学院
类型:发明
国别省市:广西,45

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