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利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法技术

技术编号:19711741 阅读:49 留言:0更新日期:2018-12-08 18:07
本发明专利技术公开了一种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法,通过同源重组的方法,将酿酒酵母木酮糖激酶基因XKS1的启动子置换为启动子PFBA1,再导入木糖还原酶XYL1、木糖醇脱氢酶XYL2表达盒,再提高转酮酶TKL1和转醛酶TAL1活性,得到重组菌1,再向重组菌1中导入法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9、鲨烯单加氧酶基因ERG1和达玛烯二醇合酶基因DS,得到重组菌2,向重组菌2中导入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH‑HMGr、法呢基焦磷酸合酶ERG20、原人参二醇合酶‑细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS‑ATR1,得到重组菌3,本发明专利技术的重组酿酒酵母菌利用木糖人工合成达玛烯二醇和原人参二醇。

【技术实现步骤摘要】
利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法
本专利技术涉及生物
,尤其涉及利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌及构建方法及应用。
技术介绍
木糖是一种戊糖,天然D-木糖是以多糖的形式存在于植物中,在自然界中迄今未发现游离状态的木糖。木质纤维素作为植物细胞壁的主要组成物质,主要包括纤维素、半纤维素和木质素三大组分。地球上每年通过光合作用产生的木质纤维素类生物质高达1000亿吨以上,是地球上储量最为丰富的可再生能源物质。而通过木质纤维素水解,可以得到丰富的葡萄糖及木糖等单糖物质。作为木质纤维素水解液中含量仅次于葡萄糖的单糖,木糖的利用引起研究人员的广泛关注。尽管有多种细菌和酵母能够天然利用木糖,但是酿酒酵母与之相比有着明显的优势,在多种工业环境压力下具有鲁棒性,比如低pH、高渗透压、高乙醇浓度和噬菌体感染。因此,酿酒酵母被广泛用来生产燃料乙醇、2,3-丁二醇、十六醇等重要工业化学品。然而,经过大量的研究发现,木糖生产乙醇的效率仍然不及葡萄糖。Kwak等提出假设酿酒酵母代谢木糖更适合于生产非乙醇类物质,并以紫穗槐二烯和鲨烯进行验证(KwakS,etal.2017,Biotechnology&Bioengineering,114(11).)。研究发现,木糖发酵时乙醇同化及胞质乙酰辅酶A合成相关酶的表达水平高于葡萄糖发酵。将与紫穗槐二烯和鲨烯合成相关的基因进行必要的扰动后,发现在木糖发酵条件下两种产物的滴度与产率均高于葡萄糖。目前,木糖已用来生产多种化学品,比如安全的甜味剂-木糖醇,生物燃料-燃料乙醇、燃料丁醇、生物柴油、氢气和甲烷,工业原料-乳酸、2,3-丁二醇、乙偶姻、3,4-二羟基丁酸、琥珀酸、富马酸,多糖-普鲁兰多糖,生物高分子材料-PHA、PHB。因此,开发木糖利用工程菌株,对于推进和加快木糖的代谢机制研究及丰富生物基化学品的种类有着重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是克服现有技术的不足,提供一种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌。本专利技术的第二个目的是提供一种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌的构建方法。本专利技术的第三个目的是提供一种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌代谢木糖的应用。本专利技术的第四个目的是提供第二种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌。本专利技术的第五个目的是提供第二种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌的构建方法。本专利技术的第六个目的是提供第二种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌代谢木糖的应用。本专利技术的技术方案概述如下:一种能够利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌的构建方法,包括如下步骤:通过同源重组的方法,将酿酒酵母内源的木酮糖激酶基因XKS1的启动子置换为强启动子PFBA1,然后向酿酒酵母的δ位点导入木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表达盒,得到重组菌;向重组菌的rDNA位点导入磷酸戊糖途径中转醛酶基因TAL1表达盒和转酮酶基因TKL1表达盒,得到快速代谢木糖的重组酿酒酵母菌1;通过同源重组的方法,向重组菌1的rDNA位点导入法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9表达盒、鲨烯单加氧酶基因ERG1表达盒和达玛烯二醇合酶基因DS表达盒,得到利用木糖生产达玛烯二醇的重组酿酒酵母菌2;通过同源重组的方法,向重组菌2的δ位点导入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH-HMGr表达盒、法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒、原人参二醇合酶-细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS-ATR1表达盒,得到利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌3;启动子PFBA1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;转醛酶基因TAL1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;转酮酶基因TKL1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示;鲨烯单加氧酶基因ERG1的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示;达玛烯二醇合酶基因DS的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH-HMGr的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示;法呢基焦磷酸合酶基因ERG20的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示;原人参二醇合酶-细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS-ATR1的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。上述方法构建的利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌3.上述方法构建的能够利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌3利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的应用。第二种利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌的构建方法,包括如下步骤:利用Cre/loxP系统回收重组菌3的his3、ura3标记,通过同源重组的方法,向重组菌3的δ位点导入乙酰辅酶A酰基转移酶基因ERG10表达盒、羟甲基戊二酰-CoA合酶基因ERG13表达盒和甲羟戊酸激酶基因ERG12表达盒,获得利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌4;乙酰辅酶A酰基转移酶基因ERG10的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示;羟甲基戊二酰-CoA合酶基因ERG13的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示;甲羟戊酸激酶基因ERG12的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。上述第二种方法构建的利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌4。上述第二种方法构建的利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌4利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇应用。实验证明,通过同源重组的方法,获得的利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌可以利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇,产量达到17.91mg/L达玛烯二醇和14.49mg/L原人参二醇,本专利技术的方法为利用木糖人工合成达玛烯二醇和原人参二醇提供了依据。附图说明图1为酿酒酵母利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的代谢路径图。图2为达玛烯二醇和原人参二醇的液相色谱检测分析结果。图3为达玛烯二醇和原人参二醇的LC-MS检测分析结果。图4为利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌达玛烯二醇和原人参二醇的产量。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。下面实施例中所使用的的试验方法如无特殊说明,均为常规方法。下面实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。所述酿酒酵母菌株为SaccharomycescerevisiaeW303-1A(美国,ATCC208352),以下简称酿酒酵母。实施例1、基因元件的扩增与制备所述木酮糖激酶XKS1启动子置换为启动子PFBA1(启动子PFBA1;核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;简单标注为SEQIDNO.1,下同);所述木糖还原酶基因XYL1表达盒由启动子PCCW12(SEQIDNO.15)、木糖还原酶基因XYL1(SEQIDNO.2)和终止子THSP26(SEQIDNO.16)组成;所述本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌构建方法,其特征是包括如下步骤:(1)通过同源重组的方法,将酿酒酵母内源的木酮糖激酶基因XKS1的启动子置换为启动子PFBA1,再向酿酒酵母的δ位点导入木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表达盒,得到重组菌;再向重组菌的rDNA位点导入磷酸戊糖途径中转醛酶基因TAL1表达盒和转酮酶基因TKL1表达盒,得到代谢木糖的重组酿酒酵母菌1;所述启动子PFBA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;转醛酶基因TAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;转酮酶基因TKL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;(2)通过同源重组的方法,向所述代谢木糖的重组酿酒酵母菌1的rDNA位点导入法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9表达盒、鲨烯单加氧酶基因ERG1表达盒和达玛烯二醇合酶基因DS表达盒,得到代谢木糖的重组酿酒酵母菌2;法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;鲨烯单加氧酶基因ERG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示;达玛烯二醇合酶基因DS的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;(3)通过同源重组的方法,向代谢木糖的重组酿酒酵母菌2的δ位点导入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH‑HMGr表达盒、法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒、原人参二醇合酶‑细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS‑ATR1表达盒,得到利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌3;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸‑羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH‑HMGr的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;法呢基焦磷酸合酶基因ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;原人参二醇合酶‑细胞色素P450还原酶融合蛋白基因PPDS‑ATR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。...

【技术特征摘要】
1.利用木糖生产达玛烯二醇和原人参二醇的重组酿酒酵母菌构建方法,其特征是包括如下步骤:(1)通过同源重组的方法,将酿酒酵母内源的木酮糖激酶基因XKS1的启动子置换为启动子PFBA1,再向酿酒酵母的δ位点导入木糖还原酶基因XYL1表达盒和木糖醇脱氢酶基因XYL2表达盒,得到重组菌;再向重组菌的rDNA位点导入磷酸戊糖途径中转醛酶基因TAL1表达盒和转酮酶基因TKL1表达盒,得到代谢木糖的重组酿酒酵母菌1;所述启动子PFBA1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;木糖还原酶基因XYL1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示;木糖醇脱氢酶基因XYL2的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示;转醛酶基因TAL1的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示;转酮酶基因TKL1的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示;(2)通过同源重组的方法,向所述代谢木糖的重组酿酒酵母菌1的rDNA位点导入法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9表达盒、鲨烯单加氧酶基因ERG1表达盒和达玛烯二醇合酶基因DS表达盒,得到代谢木糖的重组酿酒酵母菌2;法呢酰二磷酸酯法呢酰基转移酶基因ERG9的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示;鲨烯单加氧酶基因ERG1的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示;达玛烯二醇合酶基因DS的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示;(3)通过同源重组的方法,向代谢木糖的重组酿酒酵母菌2的δ位点导入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因NADH-HMGr表达盒、法呢基焦磷酸合酶基因ERG20表达盒、原人参二醇合酶-细胞色素...

【专利技术属性】
技术研发人员:卢文玉高晓
申请(专利权)人:天津大学
类型:发明
国别省市:天津,12

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