基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用制造技术

本发明专利技术涉及合成生物学领域，特别涉及基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。通过实验发现，基因YEL017C‑A、YEL017W和/或YER182W的缺失能够提高脱氧紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素、紫色杆菌素前体和/或紫色杆菌素的产量。

【技术实现步骤摘要】
基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用
本专利技术涉及合成生物学领域，特别涉及基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。
技术介绍
紫色杆菌素(violacein)、脱氧紫色杆菌素是微生物的代谢产物，属于吲哚衍生物，由两个色氨酸分子氧化缩合而成。自从19世纪末紫色杆菌素被发现以来，人们对其生物功能进行了大量的探索，发现紫色杆菌素具有很强的生物活性：(1)具有广谱的抗菌活性；(2)抗氧化；(3)抗肿瘤细胞；(4)抗病毒性；(5)抗原生动物；(6)作为染料加工各种材质布料。总之，紫色杆菌素具有很高的医学价值及工业应用前景。在已发现的产紫色杆菌素的菌株中，对紫色色杆菌(C.violaceum)的研究最为广泛。2003年，C.violaceum全基因组测序完成，为紫色杆菌素合成途径解析及应用提供了保证。紫色杆菌素的生物合成涉及一个基因簇，长约7.3kb，包括5个基因，分别是VioA、VioB、VioE、VioC和VioD。脱氧紫色杆菌素前体(prodeoxyviolacein，PDV)是紫色杆菌素合成路径的关键中间产物，可在VioC的氧化作用下产生脱氧紫色杆菌素，在VioD的氧化作用下生成紫色杆菌素前体。紫色杆菌素前体在氧化酶VioC的催化作用下最终生成紫色杆菌素。脱氧紫色杆菌素是比紫色杆菌素少一个氧原子的结构类似物，通常伴随紫色杆菌素产生，是紫色杆菌素合成途径的副产物。但是脱氧紫色杆菌素产量很低，分离困难，因此对其性质及生物活性研究较少。因此，提供一种产量高的脱氧紫色杆菌素的菌株及合成方法具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了基因的缺失及其应用，缺失该基因的菌株及其在提高微生物次级代谢产物的产量中的应用。该基因的缺失能够提高脱氧紫色杆菌素的产量。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了基因的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有基因YEL017C-A、YEL017W和/或YER182W的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因YEL017C-A、YEL017W和/或YER182W表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、与I所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列；V、如I、II、III或IV所示核苷酸序列的互补序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为真核生物，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体(PDV)、脱氧紫色杆菌素、紫色杆菌素前体和/或紫色杆菌素。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为酿酒酵母。本专利技术还提供了菌株，其基因被敲除；所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有基因YEL017C-A、YEL017W和/或YER182W的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因YEL017C-A、YEL017W和/或YER182W表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、与I所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列；V、如I、II、III或IV所示核苷酸序列的互补序列。在此基础上，本专利技术还提供了所述的菌株在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为真核生物，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体(PDV)、脱氧紫色杆菌素、紫色杆菌素前体和/或紫色杆菌素。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述微生物为酿酒酵母。此外，本专利技术还提供了脱氧紫色杆菌素的合成方法，本专利技术提供的菌株经发酵培养，收集发酵产物。本申请人对PDV产量提升、生长适应性良好的重排菌株使用合成型聚合酶链式反应标签(PCRtag)进行分析的高PDV产生的菌株进行缺失排列。在由loxPsym位点划分的170个区段中(Ring_synV染色体上一共有170个loxPsym重组位点，该170个重组位点将染色体分割为170个区域，从染色体左端起始位置起，个人进行编号1-170。)，31个包含必需基因，14个是空白DNA区段(在该DNA区段中没有基因或其他基因组特征)，22个不包含PCRTag。在其余103个区段中，其中至少有一个非必需基因，并且该基因中设计了至少一对PCRTag。必需基因的缺失或合成致死性遗传相互作用的发生会导致细胞死亡。因此，可以使用非冗余PCRTag对103个区段进行分析，每个ORF仅使用一对PCRTag。在检测到具有明显表型变化的5个SCRaMbLEd克隆中，通过PCRTag作图共检测到3个区段缺失。尽管在一些情况下，注释基因的缺失似乎不足以引起观察到的表型，但是准确地证实了YEL017C-A、YEL017W(这两个基因在同一个区段中)，YER151C和YER182W的缺失。这些基因的缺失对PDV产生的增加有影响。进而影响脱氧紫色杆菌素、紫色杆菌素前体和/或紫色杆菌素的产量。并且全基因组测序确认了YEL017C-A、YEL017W和YER182W的缺失。这些基因的缺失对PDV产量提升有关联。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示染色体重排菌株表型多样性；其中，a示第二轮重排实验中具有不同表型的菌落分布；b示合成型环形V号染色体重排菌株的表型多样性；c示每轮重排实验中颜色加深菌株所占百分比；d示基于各轮重排实验中颜色加深菌株总数量，PDV产量提升倍数分布；图2示连续获得PDV生产提升菌株；其中图2A示PDV产量提升倍数前10位菌株；图2B示重排菌株的表型分析和每轮染色体重排试验后获得菌株的PDV产量提升倍数变化；图3示全基因组测序揭示环形V号染色体单倍体酵母菌株重排后出现染色体非整倍性；覆盖深度代表由全基因组测序确定的染色体拷贝数；图4示合成型环形V号染色体拷贝数热图；不同颜色代表了基于全基因组测序的DNA拷贝数；图5示PDV产量提升重排菌株中环形V号染色体内相互作用；其中，图5a示CIRCOS图展示重排菌株yWJS067、yWJS184和yWJS321中合成型V号染色体内的结构变异位点，每条线代表位点间的相互作用；图5b示重排菌株yWJS067中合成型V号染色体与参考序列的比对；重排菌株yWJS067中合成型V号染色体(下)中出现倒位、重复、缺失和易位等重排事件；图6示全基因组测序结果揭示的新型变异结构；图7示与PDV生产提升相关的新型变异结构；其中图7a示与PDV生产提升相关的新型变异结构示意图；左侧DNA片段(橙色箭头)和右侧DNA片段(蓝色)被loxPsym位点(绿色菱形)分开；使用设计的引物(黑色箭头)扩增DNA序列并转化到yWJS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有基因YEL017C‑A、YEL017W和/或YER182W的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因YEL017C‑A、YEL017W和/或YER182W表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、与I所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列；V、如I、II、III或IV所示核苷酸序列的互补序列。

【技术特征摘要】
1.基因的缺失在提高微生物次级代谢产物的代谢通量中的应用；所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有基因YEL017C-A、YEL017W和/或YER182W的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因YEL017C-A、YEL017W和/或YER182W表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、与I所述序列具有相同功能性片段或功能性变体的核苷酸序列；V、如I、II、III或IV所示核苷酸序列的互补序列。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为真核生物，所述次级代谢产物为芳香族氨基酸下游代谢产物。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微生物为酵母，所述次级代谢产物为脱氧紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素、紫色杆菌素前体和/或紫色杆菌素。4.如权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述微生物为酿酒酵母。5.菌株，其特征在于，其基因被敲除；所述基因具有如下所示的核苷酸序列中...

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，谢泽雄，王娟，李炳志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12