一种酿酒酵母菌KMLY1-2及其分离方法和应用技术

本发明专利技术提供一种酿酒酵母菌KMLY1‑2，其微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1‑2，拉丁文学名：Saccharomyces cerevisiae.KMLY1‑2，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM 2018457。本发明专利技术从馒头酵子中分离得到的酿酒酵母菌KMLY1‑2，其发酵提取物具有特殊香气，加入卷烟产品中，具有增加烟香、柔和烟气，增加细腻性，降低刺激性，明显改善烟气质的作用，适合卷烟和新型烟草制品加香。

【技术实现步骤摘要】
一种酿酒酵母菌KMLY1-2及其分离方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种酿酒酵母菌KMLY1-2及其分离方法和应用。
技术介绍
加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格的决定性因素和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前，烟用香料按来源分为三类，即来自非烟草的天然植物香精油、浸膏等；来自非烟草的天然植物香料，如从各种植物的花、果实、根、茎、叶中提取的精油浸膏、酊剂等；人工合成的香料，如醇、醛、酮等单体香料。按香料生产方法的不同主要分为两种，即采用各种分离手段直接从烟草或其它植物中提取的天然香料和采用化学反应合成的香料。目前，这两种方法都有其优点，但均存在一定的局限性。如直接从植物中提取天然香料，虽然生产操作简单，但存在改善卷烟抽吸效果不明显等缺点；采用化学合成的香料，虽然生产过程易于控制，但也存在香气单调、不自然等缺点。近年来，随着微生物技术日新月异的发展，微生物法生产香料的工作已取得了很多进展。微生物种类丰富，长期以来人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调研和开发利用，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性也日益凸显。世界上许多国家都在搜集、保存各种微生物资源，微生物资源的不断丰富将为我国生物技术的发展奠定坚实的物质基础。色醇(Tryptophol，TOL)，广泛存在于葡萄酒和啤酒等饮料中，是一种具有多种功效的吲哚衍生物。第一，TOL具有促进睡眠作用。动物实验表明，TOL能够促进小鼠睡眠，将注射TOL剂量由200mg/Kg提高至400mg/Kg时，小鼠开始入睡时间由2.8min缩短到1.4min，小鼠睡眠持续时间由4.2min延长至14.4min。第二，TOL具有抑制病原真菌生长作用。植物内生真菌可以通过产生TOL以提高植物对其他病原真菌的抵抗力，且能够促进植物生长。第三，TOL是植物生长素吲哚乙酸(Indole-3-acetateacid，IAA)的重要前体物质，植物通过储备TOL作为合成IAA的原料库，以备植物生长所需。第四，TOL和苯乙醇作为信号分子调控flo11基因表达，从而实现酵母菌由单细胞向菌丝体转变。生物体中色醇主要有2条合成路径。其一为：色氨酸→吲哚-3-丙酮酸→吲哚-3-乙醛→色醇，此即吲哚丙酮酸途径；其二为：以磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤藓糖为起始底物，经莽草酸途径生成分枝酸，分枝酸经几步酶促反应生成色氨酸，色氨酸经吲哚丙酮酸途径合成色醇，此为从头合成途径。利用微生物对香原料进行发酵，可以增加传统提取香原料中多种香气物质的含量，提升香气丰富性。产香微生物，即能够产生具有芳香气味物质的微生物。目前，已经得到应用的产香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)、假丝酵母、乳酸菌、黑曲霉等。但是应用到卷烟和新型烟草制品中的微生物还很少，而且增香效果也不太理想。
技术实现思路
本专利技术第一方面涉及一种高产色醇的食源性酿酒酵母菌KMLY1-2，其是从山东菏泽采取馒头酵子样品中分离得到的，对其进行了形态学、生理生化性质和利用26SrDNA通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)扩增该微生物的D1/D2区序列，鉴定结果表明其属于酿酒酵母菌，微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1-2(拉丁文学名：Saccharomycescerevisiae.KMLY1-2)，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心(简称：CCTCCM)保藏，保藏编号为CCTCCM2018457，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2菌株的主要形态特征和生理生化性质特征为：菌落形态规则、卵圆形、大而厚、乳白色、表面光滑、粘稠、容易挑起，菌落质地均匀；发酵糖试验为阳性。本专利技术分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2菌株在酵母浸出粉胨葡萄糖(YeastextractpeptonedextroseMedium，YPD)培养基固体平板上，菌落颜色为乳白色或者红色，呈卵圆形，较大较厚，表面湿润、粘稠，易被挑起，且酿酒酵母菌KMLY1-2在葡萄汁固体培养基中长势最好。本专利技术所分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2的分子生物学鉴定分析显示，PCR产物长度为622bp，与NCBI数据库中的酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)具有很高的同源性(99～100％)。基于这些结果，将本专利技术所得到的微生物菌株鉴定为酿酒酵母KMLY1-2。本专利技术所分离得到的酿酒酵母菌KMLY1-2的26SrDNA的D1/D2序列如序列表所示。本专利技术第二方面涉及一种分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法，包括以下步骤：a、从山东菏泽采集馒头酵子样品若干份，利用YPD固体培养基筛选出单菌落，单菌落在YPD液体培养基中培养8～16h，保存于-80℃冰箱中；b、随机选取10株菌落，在葡萄汁固体培养基中划线分离，30℃培养48h；c、选取1株长势最好菌株，接种于YPD固体培养基，30℃培养48h。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法中，YPD固体培养基(g/L)的组成：蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％，余量为水。配制完成后，于115℃灭菌20min。上述分离、培养和鉴别如本专利技术第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法中，葡萄汁固体培养基的配制方法如下：将新鲜葡萄，用清水洗净，用物理压榨法进行打浆，按0.3～0.5％(复合酶/葡萄汁为m/v)比例，在葡萄汁中添加复合酶(复合酶包括果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、糖化酶和脂肪酶，其质量比为3:2:2:2:0.5:0.5)，45℃酶解2h，酶解后用双层纱布过滤去除残渣，将滤液置于85℃下灭菌30min，滤液用等体积蒸馏水稀释，并添加1.5wt％的琼脂，然后置于85℃下灭菌30min后，倒入平板中，备用。本专利技术所用到的葡萄产地为云南弥勒东风农场玫瑰蜜葡萄。本专利技术第三方面涉及一种酿酒酵母菌KMLY1-2制剂及其制备方法，包括如下步骤：将酿酒酵母菌KMLY1-2在YPD液体培养基中活化12h，按体积比1％接种于100mL的YPD液体培养基中，30℃静止培养24h，将2，5，10和100mL培养物在8000～10000rpm下离心10min，沉淀用无菌去离子水洗涤2次，再用100mL发酵用葡萄汁重悬菌体，即可得到接菌量体积比为2％，5％，10％和100％的酿酒酵母菌KMLY1-2制剂。上述酿酒酵母菌制剂及其制备方法，YPD液体培养基的组成为：蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，余量为水。配制完成后，于115℃灭菌20min。本专利技术第四方面涉及一种利用本专利技术第一方面所述的酿酒酵母菌KMLY1-2发酵制备色醇的方法，包括如下步骤：将本专利技术第三方面所制备的2％，5％，10％和100％酿酒酵母菌KMLY1-2制剂，于30℃恒温培养箱中发酵12h，4～5℃的冷库中发酵12h，发酵液在8000～10000rpm条件下离心10min，去除菌体，得到上清液，上清液用0.45μm滤膜过滤，采用HPLC仪测定样品中色醇的含量，并以未发酵葡萄汁作为对照。上述利用本专利技术第一方面所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酿酒酵母菌KMLY1‑2，其特征在于，其微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1‑2，拉丁文学名：Saccharomyces cerevisiae.KMLY1‑2，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM 2018457。

【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母菌KMLY1-2，其特征在于，其微生物学分类命名为酿酒酵母菌KMLY1-2，拉丁文学名：Saccharomycescerevisiae.KMLY1-2，已于2018年7月6日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCM2018457。2.一种分离、培养和鉴别权利要求1所述的酿酒酵母菌KMLY1-2的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、从山东菏泽采集馒头酵子样品若干份，利用YPD固体培养基筛选出单菌落，单菌落在YPD液体培养基中培养8～16h，保存于-80℃冰箱中；b、随机选取10株菌落，在葡萄汁固体培养基中划线分离，30℃培养48h；c、选取1株长势最好的菌株，接种于YPD固体培养基，30℃培养48h，鉴别。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤a中YPD固体培养基的组成为：蛋白胨2wt％，酵母粉1wt％，葡萄糖2wt％，琼脂1.5wt％，余量为水；YPD液体培养基包括以下组分：蛋白胨2wt...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩效伟，罗义勇，朱东来，赵伟，韩熠，刀娅，李寿波，李廷华，洪鎏，张霞，陈永宽，吴俊，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53