嗜热子囊菌基因表达系统技术方案

技术编号:19711695 阅读:43 留言:0更新日期:2018-12-08 18:06
本发明专利技术提供一种嗜热子囊菌乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株,其保藏号为CGMCC.13375。本发明专利技术还提供包含所述缺陷型菌株的嗜热子囊菌基因表达系统以及相应的目的基因的转化和表达方法,以及编码与所述pyrG缺陷型菌株相对应的乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶的分离的核酸。

【技术实现步骤摘要】
嗜热子囊菌基因表达系统
本专利技术涉及生物
,具体地说,本专利技术涉及通过紫外诱变方法,筛选出一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型的嗜热子囊菌菌株,并且涉及利用所述菌株的嗜热子囊菌基因表达系统。
技术介绍
嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)是子囊菌类的耐热真菌。最早于1907年由HugoMiehe在自发生热的干草垛中分离得到。嗜热子囊菌的孢子呈亮橘黄色椭球形,一般认为没有无性繁殖阶段。报导的嗜热子囊菌孢子萌发的最佳和最高温度分别为47.5℃和60℃左右。相应的菌丝生长的最适和最高温度则较低,分别在40-45℃和55℃。孢子萌发和菌丝生长的下限温度则分别为32.5℃-35℃和20℃-25℃。另外孢子萌发率会受菌株培养年龄的些微影响。嗜热子囊菌是一种能够高表达耐热纤维素酶的子囊菌纲真菌,可以生产一大批工业上有应用价值的酶类。这些耐热酶出色的高温稳定性和变性剂耐受性赋予其很好的工业潜力。而且嗜热子囊菌在以源自农林业废弃物,木质纤维素类生物质为基础的培养条件下可有效生长。在此类低成本的常见材料上的出色适应性使其在工业上生产纤维素酶时具有重大优势。在木质纤维素类生物质精炼方面,相对于化学转化在温度压力要求上也都温和许多。耐热酶因其在工业条件下的应用优势:(1)大量转化反应可以在更高温度下进行以降低体系粘度;(2)污染风险降低;(3)酶可以在室温有效保存而不失活。但是由于特异培养的生长速率低,大量生产商用耐热生物酶仍旧是一个经济上的挑战。所以要充分发掘它的生物技术潜能,特别是在分子和基因层面上,还有很多工作需要完成。其中很重要的一个障碍就是嗜热子囊菌还没有建立转化和遗传操作系统。因此建立一个有效的丝状真菌遗传操作系统具有重要价值。当前丝状真菌中使用的转化方法主要有:⑴原生质体-PEG转化法;⑵农杆菌介导的转化;⑶电击转化法;⑷醋酸锂转化法;⑸脂质体转化法;⑹基因枪法等(Dhawale等1984,Chakraborty等1991,Hazell等2000,Michielse等2008,Yin等2012,Chai等2013)。若要进一步开发嗜热子囊菌的工业潜力,在分子和遗传方面还有许多工作要做。但是该菌种始终没有有效可用的遗传操作系统。本专利技术通过紫外诱变的方法构建了稳定遗传的嗜热子囊菌pyrG缺陷型菌株。使用蜗牛酶处理菌丝成功地获得了具有再生活力的原生质体,克隆了可作为选择标签的该菌自身的pyrG基因、纤维二糖水解酶和内切葡萄糖苷酶的启动子,并成功的建立了嗜热子囊菌的高效转化系统并表达了外源基因。
技术实现思路
本专利技术目的是为了在嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)中构建一个外源基因的表达系统,这个系统包括宿主菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3(于2016年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号:CGMCC.13375),外源基因在该菌株的原生质体-PEG转化方法,转化子的筛选方法,即利用克隆得到的pyrG基因作为选择标签转化入该诱变株使得其恢复合成尿嘧啶的能力来筛选转化子。构建了外源基因表达的质粒及启动子系统。本专利技术成功得到一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株作为宿主菌,克隆了对应的pyrG基因作为转化的选择标签,克隆了纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的启动子用于表达外源基因,并且建立了基因转化方法,通过淀粉酶AoAMY基因的重组表达验证了该转化系统及表达外源基因的有效性。本专利技术使用紫外诱变的方法,将野生型嗜热子囊菌NBRC9748经紫外照射后使用含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基筛选,顺利取得乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3。本专利技术还构建了该菌株的原生质体-PEG转化法,并成功的将从野生型菌株中克隆得到的pyrG基因作为选择标签转化入该诱变株使得其营养缺陷型突变得到恢复。在将外源淀粉酶基因Aoamy(Wang等2014)与纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡萄糖苷酶(EG)的启动子(Pegp和Pcbhp)相融合,插入到带有乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG完整基因的质粒中,转化到尿嘧啶营养缺陷型菌株中,成功得到了表达该外源淀粉酶基因的菌株。目前为止嗜热子囊菌中的遗传操作体系未见报道。本实验通过紫外诱变实验在含有5’-FOA平板上筛选到一株尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3,通过TAIL-PCR首次获取了嗜热子囊菌pyrG基因序列,并克隆了该基因,构建了pGEM-pyrG载体。克隆了纤维二糖水解酶(Pcbhp)和内切葡萄糖苷酶的启动子(Pegp),并建立了原生质体-PEG介导转化法通过原生质体-PEG转化法将构建载体转入嗜热子囊菌pyrG突变株TA3中,成功表达了淀粉酶基因Aoamy。这是世界第一个嗜热子囊菌的外源基因表达系统。更具体地,本专利技术提供以下各项:1.一种嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株,其保藏号为CGMCC.13375。2.一种嗜热子囊菌基因表达系统,所述表达系统包含1的菌株作为宿主菌。3.2的表达系统,所述表达系统还包含用于转化所述宿主菌的载有目的基因的载体,所述载体例如是质粒。4.3的表达系统,其中所述载体包含与1的pyrG缺陷型菌株对应的pyrG基因作为转化的选择标签。5.4的表达系统,其中所述pyrG基因的序列如SEQIDNO.1所示。6.3的表达系统,其中所述载体在所述目的基因上游还包含启动子,所述启动子为纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡萄糖苷酶(EG)的启动子。7.6的表达系统,其中CBH启动子的核酸序列如SEQIDNO.3所示,EG启动子的核酸序列如SEQIDNO.2所示。8.一种分离的核酸,所述核酸编码嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶,所述核酸的核酸序列如SEQIDNO.1所示。9.一种用载有目的基因的外源核酸载体转化1的菌株的方法,所述方法包括以下步骤:用蜗牛酶处理所述菌株的菌丝以制备具有再生活力的原生质体;向获得的原生质体加入所述外源核酸载体并孵育;以及在加入所述外源核酸载体并孵育后,加入PEG溶液(例如PEG4000溶液)并孵育。10.一种利用1的菌株作为宿主菌表达目的基因的方法,所述方法包括:通过9的方法将目的基因转化到所述宿主菌中;以及对转化到所述宿主菌中的所述目的基因进行诱导表达。附图说明图1.根据本专利技术的实施方案的示意图。图2.pyrG基因缺陷型菌株的筛选A:嗜热子囊菌野生型及营养缺陷型在察氏培养基中加入0.01%尿嘧啶培养6天生长状况对比;B:嗜热子囊菌野生型及营养缺陷型在察氏培养基培养6天生长状况对比。尿嘧啶营养缺陷型菌株TA2和TA3在无尿嘧啶培养基上不能生长。图3.透明圈法测定淀粉酶活性。1,2:TA3的诱导上清液和细胞裂解液(对照);3:EGP-S-Aoamy-Tcbh-pyrG的菌株的诱导培养上清;4:EGP-Aoamy-Tcbh-pyrG菌株菌体裂解液;5:CBHP-S-Aoamy-Tcbh-pyrG菌株的诱导培养上清;6:CBHP-Aoamy-Tcbh-pyrG转化子菌体裂解液。本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种嗜热子囊菌乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株,其保藏号为CGMCC.13375。

【技术特征摘要】
1.一种嗜热子囊菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株,其保藏号为CGMCC.13375。2.一种嗜热子囊菌基因表达系统,所述表达系统包含权利要求1的菌株作为宿主菌。3.权利要求2的表达系统,所述表达系统还包含用于转化所述宿主菌的载有目的基因的载体,所述载体例如是质粒。4.权利要求3的表达系统,其中所述载体包含与权利要求1的pyrG缺陷型菌株对应的pyrG基因作为转化的选择标签。5.权利要求4的表达系统,其中所述pyrG基因的序列如SEQIDNO.1所示。6.权利要求3的表达系统,其中所述载体在所述目的基因上游还包含启动子,所述启动子为纤维二糖水解酶(CBH)或内切葡萄糖苷酶(EG)的启动子。7.权利要求6的表达系统,其中CB...

【专利技术属性】
技术研发人员:洪泂胡圣霖王冬梅
申请(专利权)人:中国科学技术大学
类型:发明
国别省市:安徽,34

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