一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法技术

一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，标准化样品的制备方法技术领域。其包括以下工艺步骤：1）样品来源；2）样品采集过程；3）提取粪便细菌；4）短期保藏；5）长期保藏；6）复苏。上述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，设计合理，通过本发明专利技术制备得到的短期保藏样品，其保藏时间可以达到1～1.5年，得到的长期保藏样品，其保藏时间可以达到7～8年。另外，无论是短期保藏样品，还是长期保藏样品，复苏的样品菌相组成都与新鲜粪便的菌相组成十分接近，并没有发生较大的偏差，且活菌率均能达到85%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法
本专利技术属于标准化样品的制备方法
，具体涉及一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法。
技术介绍
人体肠道中存在着一个庞大的微生物群落，其数量级达1011～1012个/g，种类达3000～5000种，其基因比人体基因高出100倍以上，其中主要以厌氧菌为主。肠道菌群高度活跃，能够发酵宿主未消化吸收的多糖和蛋白质，产生短链脂肪酸，它们中有些也有合成维生素、促进肠道蠕动等功能。肠道菌的有害菌能侵入肠道黏膜，引起宿主免疫反应，其有害代谢物能可能引起各种相关疾病。因此对人体肠道菌群的研究一直是科研方面的热点。目前此方面的研究主要使用体外模拟人体肠道发酵模型。该模型广泛应用于食物的营养评价研究、益生菌的益生功能研究、治疗肠道疾病药物开发研究等领域。建立体外模拟人体肠道发酵模型首要步骤就是粪便样品的收集和处理。粪便细菌是肠道菌群的代表，将粪便细菌接种于体外发酵模型中进行一段时间的连续培养，从而模拟出人体肠道发酵状态。然而不同个体的肠道微生物组成受到年龄、性别、饮食、疾病、药物和环境等因素的影响而有显著的变化。即使是同一个体，随时间的变化，其粪便菌群也会产生差异。那么，如何样本的重复利用问题以避免每次实验的差异产生。发酵模型的粪便样品到底选用单个体的单样本还是单个体的多样本混合亦或是多个体的混合样本。如果选用混合样本，由于样本过多或过少会与健康人群肠道菌群产生一定偏离，那么混合的样本数量又是多少适宜。以上问题目前在肠道体外模拟领域均没有定论。制备出能重复利用的标准化的粪便样品，对发酵模型的稳定性以及后续研究数据的可靠性具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法的技术方案。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）样品来源选择健康，且不吸烟，前3周未使用抗生素、益生菌、益生原或泻药的人员作为样品来源；2）样品采集过程取供体排尿后进行粪便采集，收集好后立即将粪便样品转移到厌氧工作站中；3）提取粪便细菌在无菌的厌氧工作站中，称取粪便样，将粪便样溶解于PBS缓冲液中，离心,得到粪便细菌提取液；4）短期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液与甘油按比例3:1～4:1的体积混合，用液氮速冻，随后保存在-80℃冰箱，得到短期保藏样品；5）长期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液中和复配保护剂按比例1：5的体积混合，调节PH至6.6～6.8，磁力搅拌15～20min，真空冷冻干燥后，得到粉末样品保存于-80℃冰箱，得到长期保藏样品；6）复苏将保藏的粪便菌样品取出，若是短期保藏样品按1:2的比与复苏液混匀，置于充10%CO2和90%N2的厌氧培养箱中37℃复苏1h；若是长期保藏样品按8%的添加量添加到复苏液中，置于充10%CO2和90%N2的厌氧培养箱中37℃复苏1.5h，即可。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤3）中厌氧工作站气体环境为10%CO2和90%N2。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤3）中每10g粪便溶解于80mL浓度为0.01M的PBS缓冲液。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤3）中离心条件：600r/min离心1～2min。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤5）中复配保护剂配方如下：麦芽糊精60～65g/L；果糖40～45g/L；蔗糖20～24g/L；脱脂奶粉40～45g/L；玉米醇溶蛋白32～36g/L；大米水解肽20～22g/L；鱼皮蛋白17～20g/L；DHA10～12g/L；甘油8～10g/L；抗坏血酸3～5g/L。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤5）中真空冷冻干燥条件为：冷休克处理条件为6℃、5h；预冻温度为-35℃；冻结物料厚度为8mm；干燥室真空度为30Pa；升华温度为28℃；解析温度为37℃。所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤6）中复苏液配方如下：磷酸氢二钾2.0～3.0g/L；氯化钠4.0～5.0g/L；七水硫酸铁0.0035～0.005g/L；一水硫酸镁0.3～0.45g/L；二水氯化钙0.3～0.4g/L；葡萄糖0.8～1.4g/L；蛋白胨1.0～1.2g/L；胆盐0.035～0.05g/L；半胱胺酸盐0.3～0.4g/L。所述的一种人体粪便菌标准样品长期保藏复配保护剂，其特征在于包括麦芽糊精60～65g/L；果糖40～45g/L；蔗糖20～24g/L；脱脂奶粉40～45g/L；玉米醇溶蛋白32～36g/L；大米水解肽20～22g/L；鱼皮蛋白17～20g/L；DHA10～12g/L；甘油8～10g/L；抗坏血酸3～5g/L。所述的一种人体粪便菌标准样品复苏液，其特征在于包括磷酸氢二钾2.0～3.0g/L；氯化钠4.0～5.0g/L；七水硫酸铁0.0035～0.005g/L；一水硫酸镁0.3～0.45g/L；二水氯化钙0.3～0.4g/L；葡萄糖0.8～1.4g/L；蛋白胨1.0～1.2g/L；胆盐0.035～0.05g/L；半胱胺酸盐0.3～0.4g/L。上述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，设计合理，通过本专利技术制备得到的短期保藏样品，其保藏时间可以达到1～1.5年，得到的长期保藏样品，其保藏时间可以达到7～8年。另外，无论是短期保藏样品，还是长期保藏样品，复苏的样品菌相组成都与新鲜粪便的菌相组成十分接近，并没有发生较大的偏差，且活菌率均能达到85%以上。附图说明图1为实施例1和实施例2中样品的菌相占比图。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例11）样品来源选择健康，且不吸烟，前3周未使用抗生素、益生菌、益生原或泻药的人员作为样品来源。2）样品采集过程取供体排尿后进行粪便采集，以避免得到尿液和粪便样本混合发酵的结果。首先在一个无人打扰的空间，随后将粪便收集器放在供体的座位下。收集好后立即将粪便样品转移到厌氧工作站中，以避免粪便中严格厌氧菌的死亡。3）提取粪便细菌在无菌的厌氧工作站中，用钥匙挖取每条粪便样品的中间部分，在天平上称取每个粪便样品5g，混合后，在厌氧工作站（气体环境为10%CO2和90%N2）中将每10g粪便溶解于80mL浓度为0.01M的PBS缓冲液（即磷酸盐缓冲液：先配制0.01mol/L的NaH2PO4和0.01mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合，配制成PH为6.6的磷酸盐缓冲液）并以600r/min的速度离心1min,去除大部分固体颗粒，得到粪便细菌提取液。4）短期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液与甘油按比例4:1的体积混合，用液氮速冻，随后保存在-80℃冰箱。短期保藏的有效期可达1～1.5年。5）长期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液中和复配保护剂按比例1：5的体积混合，用0.5mol/LNaOH和HCl调节PH至6.6，磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）样品来源选择健康，且不吸烟，前3周未使用抗生素、益生菌、益生原或泻药的人员作为样品来源；2）样品采集过程取供体排尿后进行粪便采集，收集好后立即将粪便样品转移到厌氧工作站中；3）提取粪便细菌在无菌的厌氧工作站中，称取粪便样，将粪便样溶解于PBS缓冲液中，离心,得到粪便细菌提取液；4）短期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液与甘油按比例3:1～4:1的体积混合，用液氮速冻，随后保存在‑80℃冰箱，得到短期保藏样品；5）长期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液中和复配保护剂按比例1：5的体积混合，调节PH至6.6～6.8，磁力搅拌15～20 min，真空冷冻干燥后，得到粉末样品保存于‑80℃冰箱，得到长期保藏样品；6）复苏将保藏的粪便菌样品取出，若是短期保藏样品按1:2的比与复苏液混匀，置于充10% CO2和90% N2的厌氧培养箱中37℃复苏1h；若是长期保藏样品按8% 的添加量添加到复苏液中，置于充10% CO2和90% N2的厌氧培养箱中37℃复苏1.5h，即可。

【技术特征摘要】
1.一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）样品来源选择健康，且不吸烟，前3周未使用抗生素、益生菌、益生原或泻药的人员作为样品来源；2）样品采集过程取供体排尿后进行粪便采集，收集好后立即将粪便样品转移到厌氧工作站中；3）提取粪便细菌在无菌的厌氧工作站中，称取粪便样，将粪便样溶解于PBS缓冲液中，离心,得到粪便细菌提取液；4）短期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液与甘油按比例3:1～4:1的体积混合，用液氮速冻，随后保存在-80℃冰箱，得到短期保藏样品；5）长期保藏在无菌的厌氧工作站中，将3）中的粪便细菌提取液中和复配保护剂按比例1：5的体积混合，调节PH至6.6～6.8，磁力搅拌15～20min，真空冷冻干燥后，得到粉末样品保存于-80℃冰箱，得到长期保藏样品；6）复苏将保藏的粪便菌样品取出，若是短期保藏样品按1:2的比与复苏液混匀，置于充10%CO2和90%N2的厌氧培养箱中37℃复苏1h；若是长期保藏样品按8%的添加量添加到复苏液中，置于充10%CO2和90%N2的厌氧培养箱中37℃复苏1.5h，即可。2.如权利要求1所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤3）中厌氧工作站气体环境为10%CO2和90%N2。3.如权利要求1所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤3）中每10g粪便溶解于80mL浓度为0.01M的PBS缓冲液。4.如权利要求1所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤3）中离心条件：600r/min离心1～2min。5.如权利要求1所述的一种人体粪便菌标准样品制备、保藏和重复利用的方法，其特征在于所述的步骤5）中复配保护剂配方如下：...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱炫，胥媛媛，韩剑众，向沙沙，包璇，冯潇，陈杰，陈跃文，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33