一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用，该荧光探针以苯并噻唑为荧光信号报告基团，磷酸酯键为碱性磷酸酶的作用位点。且探针具有较好的水溶性，在水溶液中呈现黄绿色荧光，向体系中加入碱性磷酸酶时，可将探针结构中的磷酸基团切割下来，形成具有红色荧光的物质，根据荧光探针黄绿色荧光降低以及产物红色荧光升高的性质开发了这种比率型荧光探针。本发明专利技术不仅可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化检测，还可用荧光法对其进行定量检测，具有选择性好、检测灵敏度高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用
本专利技术属于酶活性检测
，涉及一种用于检测细胞内源性碱性磷酸酶的方法策略。更具体地，涉及一种比率型荧光探针及其合成方法和它在检测碱性磷酸酶中的应用。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是最重要和最有效的水解酶之一，广泛存在于各种哺乳动物组织中，如肝脏、骨骼和肠道。它可以催化各种底物(包括蛋白质、核酸和碳水化合物)的水解和转磷酸化。此外，越来越多的证据表明血液中异常升高的碱性磷酸酶水平与各种疾病如癌症、心脏病、骨骼疾病和肝脏疾病有关。因此，开发特异性和灵敏检测碱性磷酸酶活性的探针在临床诊断中有重要的应用。现今对碱性磷酸酶的检测主要依赖色谱法、电化学发光法、电化学法、表面增强共振拉曼散射方法、比色法和荧光法等手段，上述方法大多需要复杂的仪器，限制了其实际应用。在诸多方法中，光谱分析手段具有较高的灵敏度和选择性，对仪器设备的门槛要求较低，并有较为广阔的商用价值，是目前具有应用价值的碱性磷酸酶分析方法。因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针，所述荧光探针的结构式为：所述比率型荧光探针以苯并噻唑环作为荧光报告基团，可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别，也可进入活细胞中对细胞内源性碱性磷酸酶进行测定。本专利技术的另一目的是提供一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针的合成方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以甲醇为反应介质，以邻氨基苯硫醇和5-甲基水杨醛为反应物，以碘单质为反应氧化剂，常温反应3～5小时至反应液呈深黄褐色，经抽滤，甲醇洗三次得到灰白色固体2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑；(2)以三氟乙酸作为反应溶剂，将步骤(1)得到的2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑加入六次甲基四胺甲酰化，于100℃反应12～24小时，反应完全冷却后用氢氧化钠溶液调节pH为中性，抽滤，滤饼干燥得到甲酰化产物；(3)向甲酰化产物中加入无水乙醇作为溶剂，再加入吡啶盐，以哌啶作为催化剂，加热回流5～6小时得到黑紫色溶液，经减压蒸馏获得黑紫色固体，纯化即得具有红色荧光的化合物；(4)将步骤(3)得到的具有红色荧光的化合物溶于干燥的二氯甲烷中，加入三氯氧磷和三乙胺，常温反应结束后减压蒸馏得到固体物质，加冰水水解，析出固体，纯化得到本专利技术的测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针。以上所述的比率型荧光探针的合成路线，如下所示：通过采用上述技术方案，本专利技术的有益效果如下：本专利技术以合成的比率型荧光探针用以碱性磷酸酶的识别检测，因其结构上含有碱性磷酸酶的识别位点磷酸基团，该荧光探针具有极好的水溶性，在水溶液中发出黄绿色荧光，在碱性磷酸酶的存在下，此探针去磷酸化后形成具有红色荧光的产物，因此可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别。优选的，步骤(1)中所述碘单质、邻氨基苯硫醇、5-甲基水杨醛、甲醇的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(1.5～2.5)：(15～20)。优选的，步骤(2)中所述2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑、六次甲基四胺、三氟乙酸的摩尔比为1：(2～3)：(15～30)。优选的，步骤(3)中所述甲酰化产物、吡啶盐、哌啶、无水乙醇的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(3～5)：(15～30)。优选的，步骤(4)中所述具有红色荧光的化合物、三氯氧磷、三乙胺、干燥的二氯甲烷的摩尔比为1：(1.5～2.5)：(3～5)：(15～30)。针对合成荧光探针反应，专利技术人通过创造性试验得到各种原料配比，其中三氯氧磷和三乙胺的配比尤为重要，其中三乙胺影响到反应的酸碱调控，关系到反应能否顺利进行；而三氯氧磷的含量直接影响到反应进行的程度，关系到反应完全及过量处理的步骤。另外，专利技术人分别通过核磁共振氢谱、碳谱、磷谱、红外光谱等手段进行表征，表明所述比率型荧光探针合成成功。优选的，合成的比率型荧光探针的最佳反应浓度为10μmol·L-1。需要说明的是，在检测过程中，若使用的荧光探针的浓度高于10μmol·L-1，其荧光会自猝灭，无法达成比率型检测的实验设想；若使用的荧光探针浓度低于10μmol·L-1，探针自身发光及其响应信号较弱，在一定程度上可能削弱检测灵敏度。优选的，碱性磷酸酶与比率型荧光探针反应的最适条件是在37℃下于pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中共同孵育60分钟。该比率型荧光探针在Tris-HCl缓冲溶液体系中能够高效选择性识别碱性磷酸酶，且对碱性磷酸酶具有很高的灵敏度。本专利技术还有一个目的，就是提供比率型荧光探针在检测碱性磷酸酶中的具体应用。优选的，所述碱性磷酸酶在人宫颈癌细胞中过渡表达，合成的荧光探针可进入活细胞对细胞内源性碱性磷酸酶进行检测。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种比率型荧光探针的合成方法及其检测细胞内源性碱性磷酸酶的应用。本专利技术公开的荧光探针含有碱性磷酸酶的识别基团，由于其本身在水溶液中具有黄绿色荧光，在加入碱性磷酸酶后，探针的磷酸基团被切割，形成的化合物具有红色荧光，通过探针黄绿色荧光强度降低，去磷酸化后的化合物红色荧光强度增强这一过程的对比，达到比率型检测碱性磷酸酶的目的。并且本专利技术所公开的用于检测碱性磷酸酶的方法策略极具市场应用与推广价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术荧光探针的1HNMR图谱。图2附图为本专利技术荧光探针的13CNMR图谱。图3附图为本专利技术荧光探针的31PNMR图谱。图4附图为本专利技术荧光探针与碱性磷酸酶反应前后的紫外吸收(a)及荧光发射(b)光谱。图5附图为相对吸光度值A496nm/A358nm与碱性磷酸酶活性的线性响应曲线。图6附图为相对荧光强度值I514nm/I650nm与碱性磷酸酶活性的线性响应曲线。图7附图(a)为本专利技术荧光探针对人宫颈癌细胞内源性碱性磷酸酶的荧光成像,图(b)为本专利技术荧光探针对矾酸钠预处理的人宫颈癌细胞内源性碱性磷酸酶的荧光成像。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种高灵敏度、高选择性的测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针及其合成方法与应用。为更好地理解本专利技术，下面通过以下实施例对本专利技术作进一步具体的阐述，但不可理解为对本专利技术的限定，对于本领域的技术人员根据上述
技术实现思路
所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本专利技术的保护范围内。本专利技术公开了一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针，所述荧光探针的结构式为：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：2.一种测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针的合成方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)以甲醇为反应介质，以邻氨基苯硫醇和5-甲基水杨醛为反应物，以碘单质为反应氧化剂，常温反应3～5小时至反应液呈深黄褐色，经抽滤，甲醇洗三次得到灰白色固体2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑；(2)以三氟乙酸作为反应溶剂，将步骤(1)得到的2-(2'-羟苯基-5'-甲基)苯并噻唑加入六次甲基四胺甲酰化，于100℃反应12～24小时，反应完全冷却后用氢氧化钠溶液调节pH为中性，抽滤，滤饼干燥得到甲酰化产物；(3)向甲酰化产物中加入无水乙醇作为溶剂，再加入吡啶盐，以哌啶作为催化剂，加热回流5～6小时得到黑紫色溶液，经减压蒸馏获得黑紫色固体，纯化即得具有红色荧光的化合物；(4)将步骤(3)得到的具有红色荧光的化合物溶于干燥的二氯甲烷中，加入三氯氧磷和三乙胺，常温反应结束后减压蒸馏得到固体物质，加冰水水解，析出固体，纯化得到本发明的测定碱性磷酸酶的比率型荧光探针。3.根据权利要求2所述的一种测定碱性磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，傅彩霞，张倩，丁彩凤，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37