具有增强的MS信号的聚糖和其它生物分子的快速荧光标记制造技术

教导和描述了可用于标记生物分子如N‑聚糖的包含具有与胺反应的活化官能团的MS活性的荧光分子的试剂及其用途。

【技术实现步骤摘要】
具有增强的MS信号的聚糖和其它生物分子的快速荧光标记本申请为一项专利技术专利申请的分案申请，其母案的申请日为2012年9月28日、申请号为201280047599.3(PCT/US2012/057996)、专利技术名称为“具有增强的MS信号的聚糖和其它生物分子的快速荧光标记”。相关申请的交叉引用本申请要求美国专利申请No.61/540,306的优先权，其并入本文中作为参考。关于联邦政府资助的研究或开发的声明无。合作研究协议各方的名称无。光盘中因引用被并入的递交材料无。专利技术背景N-聚糖的荧光标记有益于检测聚糖，因为其改进检测的灵敏性和选择性以及聚糖的色谱性能。氨基酸分析是蛋白质研究中的基本过程并且在必须监测蛋白质的糖基化特征以确保治疗产品的一致性时对临床化学家和制药商特别重要。在用具有荧光部分的试剂衍生时，只能评估该化合物的官能团。然后需要质谱法（“MS”）识别特定化合物。MS分析在聚糖与氨基酸分析和蛋白质组学方面已经达到高发展程度。但是，将大多数胺官能化所需的反应时间缓慢。现有技术状况利用(1)快速反应并具有良好荧光信号但差MS信号，或(2)极慢反应并产生良好MS/荧光信号的标记分子。但是，由于荧光检测是测定在数量上存在多少的非常有用的工具，MS和荧光检测的组合是合意的。另一方面，MS用于测定分子构成如何。因此需要与生物分子快速反应并提供强质谱和荧光信号的分子。专利技术概述在本文中描述了可用于聚糖，如N-连接聚糖和其它生物分子，如蛋白质和肽和氨基酸的快速荧光标记的MS活性分子。这些MS活性的荧光分子可具有三种功能组分：(a)叔氨基或其它MS活性原子；(b)高荧光部分，和(c)与胺快速反应的官能团，如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（succidimidylcarbamate）。该反应性官能团提供所需生物分子的快速标记，荧光部分提供强荧光信号。叔氨基取代基提供强MS信号。另一方面，在本文中提供没有荧光部分的快速标记的MS活性化合物。本专利技术特别涉及如下文即将所示的式I和式II的化合物及其在具有增强的MS信号的聚糖快速荧光标记中的用途。式I：其中R1是R2独立地选自–H、–C1-C8烷基、–C1-C8环烷基、卤素、二烷基氨基、CH2-二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基，但不是Cl或O=C=N-；且R3和R4独立地选自–H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4是烷基氨基、烷基膦酸或烷基磺酸，且其中R3和R4可与它们所连接的氮一起形成任选取代的5-至8-元饱和或部分不饱和环，但在R1是O=C=N-时除外。式II：其中m=0-9；n=0-9；R1是R2独立地选自亚甲基、取代氮、氧、羰基、酰胺、酯、硫、亚砜或砜；R3和R4独立地选自–H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4是烷基氨基、烷基膦酸或烷基磺酸，且其中R3和R4可与它们所连接的氮一起形成任选取代的5-至8-元饱和或部分不饱和环；且R5独立地选自–H、–C1-C8烷基、–C1-C8环烷基、卤素、二烷基氨基、CH2-二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基，但不是Cl或O=C=N-，并在R1是S=C=N时除外。式I和/或II的化合物可具有光学中心，因此可以以不同的对映异构体和非对映异构体构型存在。本文描述的专利技术包括式I和式II的此类化合物的所有对映异构体、非对映异构体和其它立体异构体以及外消旋化合物和外消旋混合物和它们的立体异构体的其它混合物。附图简述图1显示用(4-((2-(二乙基氨基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯标记的由0.8µgHerceptinIgG释放的聚糖G0F、G1F和G2F的荧光和MS检测。图2显示用(4-((2-(二乙基氨基)乙基)氨基甲酰基)苯基)氨基甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯标记的由0.8µgHerceptinIgG释放的聚糖G2FBS2的荧光和MS检测。详述本文中提供的式I和式II的新型化合物可用于以增强的信号快速荧光标记聚糖和氨基酸。该化合物可用于分析聚糖并可用于分析含有至少一种蛋白质和氨基酸的样品中的蛋白质和氨基酸。为了分析分子，该分子用本文所述的化合物快速标记并施以液相色谱法、质谱法和荧光检测。本文所用的术语“烷氧基”在单独或组合时是指烷基醚基团，其中术语烷基如下文定义。合适的烷基醚基团的实例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等。本文所用的术语“烷基”在单独或组合时是指含有1至20（包括20），优选1至10，更优选1至6个碳原子的直链或支链烷基。烷基可任选如本文中定义被取代。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、壬基等。本文中单独或组合使用的术语“亚烷基”是指衍生自在两个或更多个位置连接的直链或支链饱和烃的饱和脂族基团，如亚甲基（–CH2–）。本文所用的术语“烷基氨基”在单独或组合时是指经由氨基连接到母体分子部分上的烷基。合适的烷基氨基可以是单-或二烷基化的形成基团，例如N-甲基氨基、N-乙基氨基、N,N-二甲基氨基、N,N-乙基甲基氨基等。本文所用的术语“氨基”在单独或组合时是指—NRR’，其中R和R’独立地选自氢、烷基、酰基、杂烷基、芳基、环烷基、杂芳基和杂环烷基，其中任一种本身可任选被取代。本文所用的术语“芳基”在单独或组合时是指含有一个、两个或三个环的碳环芳族体系，其中这些环可以以侧接方式连接在一起或可以稠合。术语“芳基”包括芳族基团，如苄基、苯基、萘基、蒽基、菲基、二氢化茚基、茚基、轮烯基、甘菊环基、四氢萘基和联苯基。本文所用的术语“苯并(benzo)”和“苯并(benz)”在单独或组合时是指衍生自苯的二价基团C6H4=。实例包括苯并噻吩和苯并咪唑。本文所用的术语“氨基甲酸酯”在单独或组合时是指氨基甲酸（–NHCOO–）的酯，其可从氮或酸末端连接到母体分子部分上并可任选如本文中定义被取代。本文所用的术语“O-氨基甲酰基”在单独或组合时是指-OC(O)NRR’基团，其中R和R’如本文中定义。本文所用的术语“N-氨基甲酰基”在单独或组合时是指ROC(O)NR’-基团，其中R和R’如本文中定义。本文所用的术语“羰基”在单独时包括甲酰基[–C(O)H]，在组合时为–C(O)–基团。本文所用的术语“羧基”是指–C(O)OH或相应的“羧酸根”阴离子，如在羧酸盐中。“O-羧基”是指RC(O)O–基团，其中R如本文中定义。“C-羧基”是指–C(O)OR基团，其中R如本文中定义。术语“环烷基”是指通过从饱和碳环分子上除去氢而得并具有3至14个碳原子的碳环取代基。在一个实施方案中，环烷基取代基具有3至10个碳原子。环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。本文所用的术语“卤代”或“卤素”在单独或组合时是指氟、氯、溴或碘。本文所用的术语“卤代烷氧基”在单独或组合时是指经由氧原子连接到母体分子部分上的卤代烷基。本文所用的术语“卤代烷基”在单独或组合时是指其中一个或多个氢被卤素替代的具有如上文定义的含义的烷基。具体包括单卤代烷基、二卤代烷基和多卤代烷基。单卤代烷基在一个实例中可在该基团内具有碘、溴、氯或氟原子。二卤代和多卤代烷基可具有两个或更多个相同的卤素原本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.式I的化合物

【技术特征摘要】
2011.09.28 US 61/5403061.式I的化合物其中R1是R2独立地选自–H、–C1-C8烷基、–C1-C8环烷基、卤素、二烷基氨基、CH2-二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基，但不是Cl或O=C=N-；且R3和R4独立地选自–H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4是烷基氨基、烷基膦酸或烷基磺酸，且其中R3和R4可与它们所连接的氮一起形成任选取代的5-至8-元饱和或部分不饱和环，但在R1是O=C=N-时除外。2.式II的化合物其中m=0-9；n=0-9；R1是R2独立地选自亚甲基、取代氮、氧、羰基、酰胺、酯、硫、亚砜或砜；R3和R4独立地选自–H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4是烷基氨基、烷基膦酸或烷基磺酸，且其中R3和R4可与它们所连接的氮一起形成任选取代的5-至8-元饱和或部分不饱和环；且R5独立地选自–H、–C1-C8烷基、–C1-C8环烷基、卤素、二烷基氨基、CH2-二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基，但不是Cl或O=C=N-，并在R1是S=C=N时除外。3.聚糖的快速标记方法，其包括如下步骤：使前体聚糖或前体氨基酸与式I的化合物反应其中R1是R2独立地选自–H、–C1-C8烷基、–C1-C8环烷基、卤素、CH2-二烷基氨基、二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基；R3和R4独立地选自–H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4是烷基氨基、烷基膦酸、或烷基磺酸，且其中R3和R4可与它们所连接的氮一起形成任选取代的5-至8-元饱和或部分不饱和环，和形成MS活性的荧光聚糖衍生物或氨基酸衍生物。4.聚糖的快速标记方法，其包括如下步骤：使前体聚糖或前体氨基酸与式II的化合物反应其中R1是R2独立地选自亚甲基、取代氮、氧、羰基、酰胺、酯、硫、亚砜或砜；R3和R4独立地选自–H、烷基、烷基氨基、烷基磺酸、烷基膦酸，其中R3或R4是烷基氨基、烷基膦酸、或烷基磺酸，且其中R3和R4可与它们所连接的氮一起形成任选取代的5-至8-元饱和或部分不饱和环；且R5独立地选自–H、–C1-C8烷基、–C1-C8环烷基、卤素、CH2-二烷基氨基、二烷基氨基、氨基羰基、烷氧基羰基或烷氧基，但不是Cl或O=C=N-，并在R1是S=C=N时除外，和形成MS活性的荧光聚糖衍生物或氨基酸衍生物。5.借助液相色谱法和质谱法分析含有至少一种聚糖的样品中的聚糖的方法，其包括通过以适合促进标记的时间和条件使所述聚糖与根据权利要求1或2的化合物反应而标记所述样品中的聚糖；提供含有用所述化合物标记的聚糖的样品；和对标记的化合物施以液相色谱法和...

【专利技术属性】
技术研发人员：DW布劳斯米歇，Y于，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：美国,US