一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法技术

本发明专利技术一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，通过用自组装法合成壳聚糖miR‑155(microRNA‑155)分子信标纳米复合物，该壳聚糖miR‑155(microRNA‑155)分子信标纳米复合物能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，同时通过与肿瘤细胞高表达的miR‑155结合进一步抑制miR‑155的表达，从而达到抑制肿瘤的目的，可应用于肺癌细胞及肺癌荷瘤鼠活体动物成像及肿瘤治疗，具有转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低、抑瘤率高等特点，将为肺癌的早期诊断及治疗提供新思路、新方法和新技术。

【技术实现步骤摘要】
一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其是涉及一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法。
技术介绍
肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年攀升，早期诊断及早治疗是改善患者预后的关键，但是肺癌患者在病变早期往往无明显症状，就诊时大多为中晚期，丧失了治疗的最佳时机。因此从肺癌发生的“起源”着手，探寻高效、特异的早期诊断及治疗的新方法，将会对肺癌的预防、诊断及治疗产生深远的影响。肿瘤干细胞理论认为在肿瘤组织细胞中存在一群数量极少的肿瘤细胞，称为肿瘤干细胞，所有的肿瘤细胞都是由肿瘤干细胞分化来的。微小RNA(miRNA，microRNA)在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，检测NSCLC干细胞相关的miRNAs是肺癌早期诊断的一个重要策略。研究表明常见的不同肿瘤类型呈现特征性的miRNAs表达谱，这将为肿瘤的组织来源、诊断和治疗提供依据，特征性的miRNA表达谱可以作为肿瘤早期诊断和治疗分子标志物，也可判断不同肿瘤的预后、预测治疗效果。多项研究显示miR-155在NSCLC中高表达，检测肺组织内的miR-155表达水平能区分肺癌患者与非肺癌患者，而且检测肿瘤组织内的miR-155表达水平能预测患者的肿瘤复发和不良预后风险。肺癌干细胞中miR-155表达高于普通肺癌细胞，如果能够直接携带荧光物质或化疗药物靶定肺癌细胞甚至肺癌干细胞，将有望最终达到早期诊断和根治肺癌的目的。分子信标(molecularbeacon，MB)是基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)原理设计的一种高灵敏性和高特异性检测工具，实际上是一种呈茎环结构的双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对。未结合目标链时，位于其末端的荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，荧光被淬灭；当分子信标与目标链结合时，分子信标的空间构象发生改变，荧光基团远离猝灭基团，荧光信号恢复，并且结合后不会轻易分离，因此分子信标是一种特异性检测DNA、RNA和miRNA的靶向序列的发夹型核酸探针，可被用来进行核酸-核酸和活细胞内可视化研究。常规分子信标本身易被核酸酶或核结合蛋白降解，存在稳定性差、细胞摄取困难等缺点。而用锁核酸(1ockednucleicacid，LNA)修饰碱基，由于几何和立体性质改变，其在较高温度的环境中能稳定存在，抗核酸酶降解的能力显著增强，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力，且结合后不会轻易分离。利用分子信标的关键是如何获得理想的转运载体，既可有效地保护免于被降解，又可高效地将分子信标递送入宿主细胞发挥靶向识别并结合抑制核酸序列的功能。壳聚糖(chitosan，CS)纳米为天然阳离子多糖，体外及体内实验均证实了壳聚糖作为转移载体的安全性及有效性，其主要特点有：①组织相容性好、免疫原性低，毒性小；②荷正电，易与DNA分子自组装结合成纳米复合物，形成稳定的核壳结构，且对DNA有保护作用；③制作过程简单、温和，对DNA、抗体等生物大分子理化性质影响小；④壳聚糖纳米表面密集的活性氨基基团便于大分子修饰和耦联。在现有技术中，已有研究表示壳聚糖可携带化学药物递送到肿瘤部位；也有报道壳聚糖纳米携带质粒等基因用于肿瘤的治疗，但同时用于肿瘤基因诊断和治疗的报道较少。现有技术中的分子信标或者壳聚糖纳米等复合物制备方法复杂，工艺条件苛刻，且这些复合物只能用于诊断肺癌的中、晚期，这会使肺癌患者错过最佳治疗时间，影响肺癌患者的治疗，同时这些复合物在用于诊断肺癌的特异性或稳定性等方面中至少有一方面效果不佳，因此急需一种制备方法简便且可获得特异性高、稳定性好的新思路、新方法的诊断和治疗肺癌的试剂，尤其是早期可以诊断和治疗的肺癌优良试剂。
技术实现思路
为克服现有技术上的不足,本专利技术的目的是提供一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，解决现有技术中用于肺癌基因诊断和治疗的药物或试剂的制备方法复杂、工艺条件苛刻且其特异性或稳定性不佳以及只能诊断中、晚期肺癌的问题。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于肺癌基因诊断和治疗的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，包括下述步骤：将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，所述壳聚糖纳米的粒径≤300nm。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，所述纳米壳聚糖与所述分子信标的质量比为7：1。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，所述PBS缓冲液的pH为6.0。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，漩涡震荡时间为60s。实施本专利技术的用于肺癌基因诊断和治疗的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，具有以下有益效果：本专利技术的用于肺癌基因诊断和治疗的壳聚糖(CS)分子信标(MB)纳米复合物，通过用自组装法合成壳聚糖miR-155(microRNA-155)分子信标纳米复合物，该制备方法简便易行且方便工业化生产，所制得的壳聚糖分子信标纳米复合物能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，并可用于肺癌的治疗，抑制作用持续时间长，并可应用于肺癌细胞及肺癌荷瘤鼠活体动物诊断和治疗，具有转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低、抑瘤率高等特点，将为肺癌的基因诊断和治疗提供新思路、新方法和新技术，尤其是针对肺癌的早期诊断；另外目前研究关于细胞和动物活体成像及治疗方面，主要是在蛋白方面研究，而本研究是利用高表达的基因进行成像和治疗，国内外报道几乎没有，属于首创。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法的具体实现作进一步说明：本专利技术涉及一种将壳聚糖纳米与分子信标结合，通过识别肺癌细胞或肺癌干细胞内高表达的micro-RNA的表达来识别、杀灭癌细胞，通过荧光成像实现对肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞的识别功能及持续监测，达到肺癌基因诊断和治疗的目的。为此本专利技术提供的一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其具体实施例如下，但本专利技术的内容不仅仅局限于以下实施例。实施例1-7为用于肺癌基因诊断和治疗的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备。其中壳聚糖纳米只要为纳米级别均在本专利技术的保护范围之内，优选为≤300nm，更优选为≤200nm，这样的壳聚糖纳米制备的壳聚糖分子信标纳米复合物具有稳定性好、转染效率高、特异性强的特点。实施例1：将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1的比例在pH6.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60-120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。实施例2：将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比8：1的比例在pH＝6.5的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60-120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。实施例3：将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比10：1的比例在pH＝7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60-120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。上述实施例中，将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH 6.0‑7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。

【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖纳米的粒径≤300nm。3.根据权利要求1所述的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱海振，郭熠，朱海燕，候净，刘鑫，胡建军，江飞龙，李杭，谭诗生，杨飞月，俞婕，崔媛媛，
申请(专利权)人：贵州省人民医院，
类型：发明
国别省市：贵州,52