SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用。实验表明，在新生大鼠缺氧缺血后2小时腹腔注射5～25mg/kg SAG均可减轻脑梗死；给与15mg/kg SAG后进一步研究发现，SAG可明显改善脑损伤，减轻缺氧缺血后神经细胞崩解、坏死。Morris水迷宫实验显示，给与15mg/kg SAG可有效改善缺氧缺血大鼠的学习能力。进一步研究显示，SAG中剂量实验组大鼠(15mg/kg SAG)的2,3,5‑氯化三苯基四氮唑阳性细胞明显减少，大脑皮质IL‑1β、TNF‑αmRNA减少，胶质纤维酸性蛋白的表达减少。

【技术实现步骤摘要】
SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用
本专利技术涉及SmoothenedAgonist(简称SAG)的用途，尤其是在制药中的用途。
技术介绍
缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemicencephalopathy,简称HIE)是新生儿常见的神经系统疾病，可导致癫痫、脑瘫、生长发育迟滞等，给社会和家庭带来沉重负担。尽管经过几十年的研究，但HIE的发病机制仍不完全清楚，临床缺乏有效治疗手段，因此积极探寻HIE的干预和治疗手段具有重要和积极意义。临床上现有的治疗手段非常有限，主要是亚低温和对症支持治疗。SmoothenedAgonist(简称SAG)是小分子合成物质，分子式为C28H29Cl2N3OS，分子量526.52，化学结构式如下：SAG现在主要用于唐氏综合症、脑卒中、糖皮质激素对新生儿小脑损伤治疗的研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于证明SAG的新用途，即在制药中的新用途，为治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病提供新的药品。本专利技术通过实验证明：在新生大鼠缺氧缺血后2小时腹腔注射5～25mg/kgSAG均可减轻脑梗死。给与15mg/kgSAG后进一步研究发现，苏木素-伊红(hematoxylinandeosin,H&E)染色显示SAG可明显改善脑损伤，减轻缺氧缺血后神经细胞崩解、坏死。Morris水迷宫实验显示，SAG中剂量实验组(15mg/kg)在第1-4天游泳平均时间与溶剂对照组比较，无明显差异；然而在第5、6天SAG中剂量实验组的大鼠游泳过程中平均潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义，说明SAG中剂量可有效改善缺氧缺血大鼠的学习能力。进一步研究显示，SAG中剂量实验组大鼠的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazouliumtydrochloride,TUNEL)阳性细胞明显减少，说明凋亡减轻。大脑皮质IL-1β、TNF-αmRNA减少，免疫荧光显示胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的表达减少。因此，可将SAG作为治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药品。本专利技术具有以下有益结果：1、本专利技术对已知的小分子合成物质SAG发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。2、本专利技术为新生儿缺氧缺血脑病的治疗提供一种有效的新药品，具有明显的社会效益和经济效益。附图说明图1是建模48小时TTC检测实验大鼠的脑梗死结果照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-1为SAG高剂量实验组，HI-2为SAG中剂量实验组,HI-3为SAG低剂量实验组。图2是实验动物的状态照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-1为SAG高剂量实验组，HI-2为SAG中剂量实验组,HI-3为SAG低剂量实验组。图3是Morris水迷宫实验中，实验大鼠训练天数与潜伏期时间的变化曲线图，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。图4是Morris水迷宫实验中，实验大鼠穿越平台次数图，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。图5是H&E染色观察实验大鼠脑组织病理改变的照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。图6是TUNEL染色检测实验大鼠建模12小时、24小时、48小时细胞凋亡的照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。图7是免疫荧光检测建模后7天即生后14天实验大鼠的GFAP表达情况图，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。具体实施方式1、实验材料与试剂1.1、实验动物健康清洁级7日龄新生SD大鼠，雌雄不限，体重14-22克，购自成都达硕实验动物有限公司。实验分为两部分，第一部分确定适合的SAG浓度。随机分为假手术组，溶剂对照组，SAG高剂量实验组(25mg/kg)，SAG中剂量实验组(15mg/kg)，SAG低剂量实验组(5mg/kg)，每组12只SD大鼠。溶剂对照组和SAG高剂量实验组、SAG中剂量实验组、SAG低剂量实验组在建模后2小时分别腹腔注入溶剂(双蒸水)或相应浓度的SAG。根据TTC和H&E染色结果确定SAG适合剂量组。第二部分将随机分为假手术组、溶剂对照组、SAG中剂量组(15mg/kg)，每组45只SD大鼠。取缺氧缺血后12小时、24小时、48小时行TUNEL检测细胞凋亡情况。缺氧缺血后24小时，荧光定量PCR检测Gli1、TNF-α,IL-1β的表达。取缺氧缺血后7天脑组织，用于免疫荧光检测GFAP表达。取建模后24小时、48小时及7天的脑组织采用H&E染色观察光镜下组织损伤情况。建模后21天即大鼠生后28天Morris水迷宫实验。1.2、主要试剂SAG(Selleck，美国)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，美国)，小鼠抗鼠β-actin抗体(成都正能生物技术公司)；辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(成都正能生物技术公司)；小鼠抗大鼠GFAP单抗(Millipore，美国)，Cy3标记驴抗小鼠二抗(Jackson)，BCA蛋白定量检测试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；DAPI染液(Beyotime)，叠氮钠(Solarbio)，琼脂糖(OXOID)，抗荧光淬灭封片剂(Solarbio)；牛血清白蛋白(Gibco)，新鲜胎牛血清(Gibco)，Triton-x-100(Solarbio)；异丙醇，苯酚，氯仿，无水酒精，DEPC(Sigma)，TRIzol(Invitrogen，15596-026)；qPRCGreenMasterMix试剂盒(Vazyme)。引物由上海生工公司合成。2、实验方法2.1、实验动物模型建立溶剂对照组和SAG高剂量实验组、SAG中剂量实验组、SAG低剂量实验组的7日龄新生SD大鼠经异氟烷麻醉后，仰卧位固定，质量浓度75％酒精消毒颈部皮肤，颈正中一切口，暴露并结扎左侧颈总动脉上下端，双节之间离断，缝合皮肤切口，再次局部消毒。术后置于37℃加热垫复温1小时，1小时后将大鼠放入缺氧舱。设置缺氧舱氧气工作浓度，使缺氧舱内氧气维持于(8.0±0.1)v.％，6v.％氧气和94v.％氮气的低氧混合气1～2L/min往缺氧舱通气，以氧气浓度稳定维持在设定温度为计时起点，低氧通气2.5小时。假手术组仅分离左侧颈总动脉，不结扎，再消毒缝合切口，不进行低氧通气。2.2、石蜡切片标本制备2.2.1标本固定用医用注射器抽取生理盐水和质量浓度4％多聚甲醛各50ml，连接头皮针备用。新生大鼠用异氟烷麻醉后仰卧位固定，剪开胸腔暴露心脏。剪开右心耳，并将连接50ml生理盐水注射器的头皮针从心尖刺入左心室，匀速推注生理盐水以冲洗血液至流出液清亮。然后心脏推注质量浓度4％多聚甲醛，大鼠四肢完全僵直后，开颅取脑。取出的脑组织固定于质量浓度4％多聚甲醛中，放置于4℃冰箱约36-48h。2.2.2取材根据大鼠脑立体定位图谱第三版，将固定好的新生大鼠鼠脑以前囟视交叉为起点，冠状位切除前面的不需要的脑组织，向后约5mm冠状切除后面的脑组织，保留中间部位的组织，并置于水中15min，中间换水3-4次。2.2.3脱水、透明及石腊包埋60℃浸蜡1.5h×2次，石蜡包埋。2.2.4石蜡切片制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于SAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：母得志，黄兰，屈艺，李世平，应俊杰，赵凤艳，童煜，唐军，石晶，王华，夏斌，张莉，杨晓燕，熊涛，王炎，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：四川,51