一种酶标抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种制备酶标抗体的新方法。由于酶联免疫吸附测定法在实际应用中经常存在一些不可避免的问题，特别是基于共价结合的酶标抗体的繁琐制备。因此，本发明专利技术将抗体与具有过氧化物酶催化活性的金属有机框架(MOF)结合形成双功能的MOF/抗体复合材料，该双功能的MOF/抗体复合材料能够应用于比色免疫分析法。MOF非但不影响抗体对抗原的捕获能力，而且能使抗体免受高温和生物降解影响，增强了抗体的稳定性。更重要的是，在比色免疫分析实验中，具有过氧化物酶催化活性的MOF可起信号放大作用，提高检测灵敏度。本发明专利技术的方法具有操作简便、成本低和效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种酶标抗体的制备方法
本专利技术涉及利用催化性MOF与抗体结合制备酶标抗体进行比色免疫分析，特别是利用MOF与抗体结合制备酶标抗体这一方法，属于MOF作为生物传感器材料的制备及应用领域。
技术介绍
酶联免疫吸附测定法(ELISA)是一种常见的分析方法，其广泛应用于疾病诊断、环境分析、食品监控等方面。这是因为它有着操作简便，灵敏度高，专一性好等优势。但是，在实际应用中仍然存在一些问题，其中，最值得关注的问题是酶标抗体的制备与纯化。传统的酶标抗体通常用酶和抗体通过共价结合制备得到，由于共价结合过程繁琐，部分酶不可避免地会失活，抗体对抗原的识别效率也会随之降低，结果导致免疫系统检测灵敏度相对降低。而且，酶是一种天然蛋白质，稳定性容易受到外界环境的影响，虽然有研究者利用催化性纳米材料或者他们的复合物来代替自然酶，但是两者之间的复杂共价连接仍然无可避免。因此，在ELISA的实际应用中，简单、低费用、高效的酶标抗体制备方法仍然必不可少。金属有机框架(MOF)是一种由金属离子和有机配体构建的混合材料。由于其大的比表面以及可调节的多孔结构和性能，使其在各个领域得到了广泛的研究。特别是通过用MOF作载体包埋生物分子构建MOF复合物，这一研究近年来受到了广泛的关注。典型的例子是MOF作载体包埋自然酶，其中包括辣根过氧化物酶(HRP)。与传统的游离酶相比，MOF作载体不仅可提供较高的包埋效率，而且可保护酶较少受外界环境的影响。与此同时，通过与酶的协调作用，MOF能有效防止酶损失。因此，通过用MOF包埋酶，可以有效改善酶的催化活性。更重要的是，最近有研究表明用MOF包埋酶后，即使在变性条件下，酶的结构以及生物功能仍得以保持。然而，目前的研究主要集中于包埋自然酶，以提高其催化活性，用MOF包埋其他生物分子却鲜有报道。特别是催化性MOF作载体包埋抗体达到信号放大效果仍处于探索中。
技术实现思路
针对传统的酶标抗体的制备方法繁琐、酶活性损失大、产率低等技术现状，本专利技术提供一种新的酶标抗体的制备方法，该方法将抗体与具有过氧化物酶催化活性的金属有机框架(MOF)结合形成双功能的MOF/抗体复合材料(酶标抗体)。本专利技术采用的技术方案为：一种酶标抗体的制备方法，其特征在于：包括使抗体与具有过氧化物酶催化活性的金属有机框架结合的步骤。所述方法的具体步骤为：将金属盐水溶液与配体的乙醇-水(v/v＝1:1)混合溶液混合，加入一定量的抗体，在4℃条件下反应一段时间后，分离出固态产物，即得到所述的酶标抗体。优选的，所述的金属盐是二水合氯化铜(CuCl2·2H2O)。优选的，所述的配体是4,4’-联吡啶。优选的，所述的抗体是兔抗鼠IgG(RIgG)。优选的，所述的金属盐与配体的摩尔比为1:4。优选的，所述的反应时间为12h。优选的，通过离心分离出固态产物，离心条件为13000rpm、5min。优选的，还包括洗涤步骤，用水洗涤固态产物3次。该方法中，由于不含有毒元素、条件温和，抗体仍保持对抗原的捕获能力，而且MOF能保护抗体免受高温和生物降解的影响，从而能提高抗体的稳定性。通过本专利技术方法制备得到的酶标抗体能够用于比色免疫分析。在比色免疫分析中，具有过氧化物酶催化活性的MOF可起信号放大作用，提高检测灵敏度。本专利技术的有益效果：本专利技术的方法操作简便，价格低且效率高。MOF非但不影响抗体对抗原的捕获能力，而且能保护抗体免受高温和生物降解的影响，增强抗体的稳定性。更重要的是，在比色免疫分析中，具有过氧化物酶催化活性的MOF可起信号放大作用，提高检测灵敏度。附图说明图1为Cu-MOF与RIgG@Cu-MOF的扫描电镜图。图2为Cu-MOF与RIgG@Cu-MOF的X射线衍射图。图3为证明Cu-MOF具有模拟酶活性的紫外吸收光谱图。图4为RIgG@Cu-MOF对小鼠IgG(mIgG)的识别紫外吸收光谱图。图5为RIgG@Cu-MOF和辣根过氧化物酶标RIgG(HRP-RIgG)储存稳定性的比较图。图6为RIgG@Cu-MOF和HRP-RIgG酶降解稳定性的比较图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进行进一步阐述。在以下的实施例中，金属有机框架标记为MOF，具有过氧化物酶催化活性的二价铜离子金属有机框架标记为Cu-MOF，兔抗鼠IgG标记为RIgG，小鼠IgG抗原标记为mIgG，MOF/抗体复合物(酶标抗体)标记为RIgG@Cu-MOF。实施例1按照以下步骤制备RIgG@Cu-MOF：(1)将0.7mg二水合氯化铜溶于1mL水中，得到二水合氯化铜水溶液；(2)将乙醇与水按v/v＝1:1混合，形成1mL乙醇-水混合溶液，再加入2.4mg4,4’-联吡啶配体，得到4,4’-联吡啶配体的乙醇-水混合溶液；(3)将1mL二水合氯化铜水溶液与1mL配体的乙醇-水混合溶液混合，加入0.1mgRIgG，在4℃下搅拌12h后离心(13000rpm,5min)，并用水洗涤3次，得到RIgG@Cu-MOF。实施例2结合3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)氧化实验，利用紫外分光光度计记录其最大吸收峰对应的吸光度，以证明Cu-MOF的模拟酶活性。其方法步骤为：(1)以pH＝4.0的醋酸钠(NaAc)作为缓冲溶液，总体积100μL，反应温度37℃；(2)用3支0.5mL离心管，分别编号为a、b、c。离心管a中溶液的配制方法为：取3μL2mg/mL3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)于97μLpH＝4.0的醋酸钠(NaAc)缓冲溶液中，37℃水浴反应30min；(3)离心管b中溶液的配制方法为：取3μL2mg/mLTMB，2μL100mM过氧化氢H2O2于95μLpH＝4.0的醋酸钠(NaAc)缓冲溶液中，37℃水浴反应30min；(4)离心管c中溶液的配制方法为：取4μL0.5mg/mLCu-MOF，3μL2mg/mLTMB，2μL100mMH2O2于91μLpH＝4.0的醋酸钠(NaAc)缓冲溶液中，37℃水浴反应30min；(5)30min后离心管c为蓝色，其余离心管为无色。将3支离心管中的样品分别利用紫外分光光度计在655nm处测定其最大吸收峰对应的吸光度。实施例3证明RIgG@Cu-MOF能识别mIgG，利用96孔板配制溶液，随后利用紫外分光光度计记录最大吸收峰对应的吸光度。具体方法是：(1)利用96孔板，分别对反应孔编号为a、b、c，反应孔a、b、c分别用包被缓冲液(pH＝9.6浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液)稀释RIgG至终浓度为10μg/mL，4℃反应12h，用400μL洗涤缓冲液(pH＝7.4，含0.05％Tween-20的0.15mol/L的碳酸盐缓冲液)洗涤反应孔4次，以除去未固定的RIgG，倒去洗涤液；(2)反应孔a、b、c分别加400μL封闭剂(含1％BSA的洗涤缓冲液)，37℃反应40min，洗涤3次；(3)反应孔a、b、c分别加入终浓度为100ng/mL的mIgG，37℃反应45min，洗涤4次；(4)反应孔a做空白，不加酶标抗体，反应孔b中加入终浓度为12μg/mL的RIgG@Cu-MOF，反应孔c中加入终浓度为10μg/mL的HRP-RIgG，37℃反应50min，洗涤5次，以除去未反应的HRP-RIgG或RIgG@Cu-M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶标抗体的制备方法，其特征在于，包括使抗体与具有过氧化物酶催化活性的金属有机框架结合的步骤。

【技术特征摘要】
1.一种酶标抗体的制备方法，其特征在于，包括使抗体与具有过氧化物酶催化活性的金属有机框架结合的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：将金属盐水溶液与配体的乙醇-水混合溶液混合，加入一定量的抗体，在4℃条件下反应一段时间后，分离出固态产物，即得到所述的酶标抗体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的金属盐是二水合氯化铜，所述的配体是4,4’-联吡啶，所述的抗体是兔抗鼠IgG。4.根据权利要求2所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭宏亮，王彩红，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36