一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒，涉及畜牧领域。本发明专利技术利用crRNA的特异性和RPA引物的特异性有效保证对病毒检测的正确度，且在常温下1～2小时之内即可通过试纸确定是否感染及感染蓝耳病病毒的亚型，相比传统基于PCR的检测方法精确度有所提高。本发明专利技术可以形成配有纯化的冻干LwaCas13a和crRNA试剂盒，可以在现场，如猪场，屠宰场方便快速地对猪蓝耳病病毒进行检测，且不需要复杂的控温仪器如PCR仪和离心机等复杂设备，只需要一个恒温装置即可快速获得可以用肉眼观测的结果，可以更加高效地了解猪场的健康状况，避免损失，为蓝耳病的检测提供更低成本，快速方便的检测方法。

A Rapid Field Detection Method and Kit for Detecting PRRSV

The invention discloses a field rapid detection method and a kit for detecting PRRSV, which relates to the field of animal husbandry. The invention effectively guarantees the accuracy of virus detection by using the specificity of crRNA and RPA primers, and can determine whether to infect or infect the subtype of Blue Ear Disease virus within 1-2 hours at room temperature, which improves the accuracy of detection method based on traditional PCR. The invention can form a * * kit with purified lyophilized LwaCas13a and crRNA, which can detect pigs' blue ear disease quickly and conveniently at the scene, such as pig farms and slaughterhouses, and does not require complicated temperature control instruments, such as PCR instruments and centrifuges. It can be obtained quickly by only one constant temperature device. As a result, the health status of pig farms can be more effectively understood, loss can be avoided, and a more cost-effective, fast and convenient detection method for blue-ear disease detection can be provided.*

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒
本专利技术涉及畜牧领域，具体涉及一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法及试剂盒，具体是利用Cas13/crRNA特异性现场快速识别并检测PRRSV病毒。
技术介绍
猪蓝耳病是由猪蓝耳病病毒(PRRSV)引发的一种传染性猪疾病。猪蓝耳病可以引起母猪出现繁殖障碍并致使仔猪出现严重呼吸道疾病症状，严重影响经济效益。中国是猪蓝耳病的重要疫区，中国分离得到的病毒株多为高致病性株，为中国养猪业带来大量损失。然而目前该病毒的检测方法检测时间较长，且对仪器的要求较高。对于该病毒的检验较为常用的方法主要有病毒分离，病毒抗原抗体检测，基于PCR等逆转录及核酸扩增的检查方法，血清抗原检测等。这些方法虽然可以有效检验PRRSV病毒，但是存在检查周期长，实验条件要求高等问题，而且这些方法一般需要采取猪的心，脾，肾，肺，淋巴结，血液等组织，难以在缺乏实验设施的检测现场如养殖场，屠宰场实时快速地进行病毒的检测，尤其不适合养殖场所。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法。该方法是一种利用LwaCas13a/crRNA系统进行PRRSV病毒的检测方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，包括纯化的冻干LwaCas13a、欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、报告RNA分子；为了更好的实现本专利技术，所述试剂盒还包括RehydrationBuffer、RNaseInhibitor、冻干RPA反应微球、MgAc、MgCl2、核酸检验缓冲溶液、ATP、GTP、UTP、CTP、T7polymerasemix；所述的核酸检验缓冲溶液为40mMTris-HCl，60mMNaCl，6mMMgCl2，调pH至7.3。所述的欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为EU-crRNA-1(SEQIDNO：1)、EU-crRNA-2(SEQIDNO：2)和EU-crRNA-3(SEQIDNO：3)中的至少一种；所述的美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为NA-crRNA-1(SEQIDNO：4)、NA-crRNA-2(SEQIDNO：5)和NA-crRNA-3(SEQIDNO：6)中的至少一种；所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为EU-RPA-target1-F/R引物组(SEQIDNO：7、8)和EU-RPA-target2-F/R引物组(SEQIDNO：9、10)中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为NA-RPA-target1-F/R引物组(SEQIDNO：11、12)和NA-RPA-target2-F/R引物组(SEQIDNO：13、14)中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段；所述的报告RNA分子为SEQIDNO：15。一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：1)对PRRSV病毒的两个重要亚型，即欧洲型，美洲型设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA的序列如序列表中SEQIDNO：1～6所示，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接合成；具体的，欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为EU-crRNA-1(SEQIDNO：1)、EU-crRNA-2(SEQIDNO：2)和EU-crRNA-3(SEQIDNO：3)中的至少一种；美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为NA-crRNA-1(SEQIDNO：4)、NA-crRNA-2(SEQIDNO：5)和NA-crRNA-3(SEQIDNO：6)中的至少一种；2)LwaCas13a蛋白的表达和纯化；3)针对步骤(1)所述的两个重要亚型的靶点设计RT-RPA引物，引物序列如序列表中SEQIDNO：7～14所示，对病毒样品进行预处理并进行RT-RPA反应；具体的，所述的RT-RPA引物包括针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物，针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物；所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为EU-RPA-target1-F/R引物组(SEQIDNO：7、8)和EU-RPA-target2-F/R引物组(SEQIDNO：9、10)中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为NA-RPA-target1-F/R引物组(SEQIDNO：11、12)和NA-RPA-target2-F/R引物组(SEQIDNO：13、14)中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段；4)将RT-RPA反应产物进行体外转录和纯化；5)将步骤(1)所述的纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、RT-RPA体外转录产物、LwaCas13a、报告RNA分子以适当比例混合于适当体系中进行反应；6)反应产物通过侧流免疫层析试纸获得检测结果。优选的，步骤(1)中所述的将设计的crRNA序列的合成方法为：构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接化学合成，但不限于此。优选的，步骤(1)中所述的欧洲型PRRSV病毒基因组指NCBI登陆号为AY366525，AY588319，DQ489311，DQ864705，EU076704，GQ461593，JF276430，JF276431，JF276432，JF276433，JF276434，JF276435，JX187609，KC492504，KC492505，KC492506，KM196101，LEYPOLYENV的核酸序列。优选的，步骤(1)中所述的美洲型PRRSV病毒基因组指NCBI登陆号为AF066183，AF331831，AY032626，AY150312，AY262352，AY457635，DQ459471，EF075945，EF112445，EF112447，EF488739，EF635006，EU106888，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括纯化的冻干LwaCas13a、欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、针对欧洲型PRRSV病毒的RT‑RPA引物、针对美洲型PRRSV病毒的RT‑RPA引物、报告RNA分子；所述的欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQ ID NO：1所示的EU‑crRNA‑1、SEQ ID NO：2所示的EU‑crRNA‑2和SEQ ID NO：3所示的EU‑crRNA‑3中的至少一种；所述的美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQ ID NO：4所示的NA‑crRNA‑1、SEQ ID NO：5所示的NA‑crRNA‑2和SEQ ID NO：6所示的NA‑crRNA‑3中的至少一种；所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT‑RPA引物为SEQ ID NO：7、8所示的EU‑RPA‑target1‑F/R引物组和SEQ ID NO：9、10所示的EU‑RPA‑target2‑F/R引物组中的至少一种；所述的EU‑RPA‑target1‑F/R引物组用于扩增含有与EU‑crRNA‑1和/或EU‑crRNA‑2互补的核酸片段；所述的EU‑RPA‑target2‑F/R引物组用于扩增含有与EU‑crRNA‑3互补的核酸片段；所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT‑RPA引物为SEQ ID NO：11、12所示的NA‑RPA‑target1‑F/R引物组和SEQ ID NO：13、14所示的NA‑RPA‑target2‑F/R引物组中的至少一种；所述的NA‑RPA‑target1‑F/R引物组用于扩增含有与NA‑crRNA‑1互补的核酸片段；所述的NA‑RPA‑target2‑F/R引物组用于扩增含有与NA‑crRNA‑2和/或NA‑crRNA‑3互补的核酸片段。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括纯化的冻干LwaCas13a、欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列、针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物、报告RNA分子；所述的欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQIDNO：1所示的EU-crRNA-1、SEQIDNO：2所示的EU-crRNA-2和SEQIDNO：3所示的EU-crRNA-3中的至少一种；所述的美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQIDNO：4所示的NA-crRNA-1、SEQIDNO：5所示的NA-crRNA-2和SEQIDNO：6所示的NA-crRNA-3中的至少一种；所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQIDNO：7、8所示的EU-RPA-target1-F/R引物组和SEQIDNO：9、10所示的EU-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的EU-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-1和/或EU-crRNA-2互补的核酸片段；所述的EU-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与EU-crRNA-3互补的核酸片段；所述的针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQIDNO：11、12所示的NA-RPA-target1-F/R引物组和SEQIDNO：13、14所示的NA-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的NA-RPA-target1-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-1互补的核酸片段；所述的NA-RPA-target2-F/R引物组用于扩增含有与NA-crRNA-2和/或NA-crRNA-3互补的核酸片段。2.根据权利要求1所述的用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RehydrationBuffer、RNaseInhibitor、冻干RPA反应微球、MgAc、MgCl2、核酸检验缓冲溶液、ATP、GTP、UTP、CTP、T7polymerasemix；所述的核酸检验缓冲溶液为40mMTris-HCl，60mMNaCl，6mMMgCl2，调pH至7.3。3.根据权利要求1或2所述的用于检测PRRSV的现场快速检测试剂盒，其特征在于：所述的报告RNA分子为SEQIDNO：15。4.一种用于检测PRRSV的现场快速检测方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：1)对PRRSV病毒的两个重要亚型，即欧洲型，美洲型设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA的序列，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接合成；其中，欧洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQIDNO：1所示的EU-crRNA-1、SEQIDNO：2所示的EU-crRNA-2和SEQIDNO：3所示的EU-crRNA-3中的至少一种；美洲型PRRSV病毒的特异性crRNA序列为SEQIDNO：4所示的NA-crRNA-1、SEQIDNO：5所示的NA-crRNA-2和SEQIDNO：6所示的NA-crRNA-3中的至少一种；2)LwaCas13a蛋白的表达和纯化；3)针对步骤(1)所述的两个重要亚型的靶点设计RT-RPA引物，对病毒样品进行预处理并进行RT-RPA反应；其中，所述的RT-RPA引物包括针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物，针对美洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物；所述的针对欧洲型PRRSV病毒的RT-RPA引物为SEQIDNO：7、8所示的EU-RPA-target1-F/R引物组和SEQIDNO：9、10所示的EU-RPA-target2-F/R引物组中的至少一种；所述的EU-RPA-targe...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄黎珍，林浩斯，钟国瑞，李浩健，杜红丽，白静，何昌生，谢水林，戴仁科，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44