与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记及其应用与引物制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域。与黄瓜单性结实基因QTL紧密连锁的InDel标记，命名为Chr7InDel01。Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处。本发明专利技术还提供了一组用于检测上述与黄瓜单性结实基因相关的InDel标记的引物对。本发明专利技术还提供了上述Chr7InDel01在黄瓜强/弱单性结实性品种鉴定中的应用。本发明专利技术运用变异组学与群体遗传学的方法获得了与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实品种选育的进程。

InDel Marker Closely Linked to Cucumber Parthenogenetic Fruiting Gene and Its Application and Primers

The invention belongs to the field of genetic engineering technology. The InDel marker closely linked to the parthenocarpic gene QTL in cucumber was named Chr7InDel01. Chr7InDel01 is located on chromosome 4,108,811 of cucumber chromosome 7. The present invention also provides a set of primer pairs for detecting the InDel markers associated with cucumber parthenocarpic genes. The invention also provides the application of Chr7InDel01 in the identification of strong/weak parthenocarpy cucumber varieties. The invention obtains InDel markers closely linked to cucumber parthenocarpic genes by means of variation histology and population genetics, detects cucumber genotypes by sequencing and designing primers, judges the strength of parthenocarpic fruiting of cucumber according to genotypes, thus speeding up the process of selection and breeding of cucumber parthenocarpic fruiting varieties.

【技术实现步骤摘要】
与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记及其应用与引物
本专利技术属于基因工程及分子生物学领域，涉及一个与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记。
技术介绍
黄瓜是我国主要的蔬菜作物之一，种植面积和产量均居世界第一。在设施栽培条件下，少或无虫媒和低温弱光会导致黄瓜授粉受精不良，结实率低下，降低早熟栽培或反季节栽培应有的效益。单性结实是指其子房不经过授粉受精或别的刺激而发育成果实的现象，强单性结实性黄瓜品系在不良环境中也可以获得稳定的结实率，而且单性结实的果实因不受精而无籽，瓜瓤偏少，果肉较厚，口感比有籽黄瓜好很多，其商品价值也高。有研究表明，黄瓜种子的发育对茎蔓的生长和后续的坐果有强烈的抑制作用，这样会导致黄瓜的光合面积减少，产量降低。因此，强单性结实性的种质资源是黄瓜良种选育的重要基础。关于黄瓜单性结实QTL及分子标记的分析工作一直是研究的热点领域。陈学好等(2008)发现了一个与黄瓜非单性结实基因遗传连锁距离为18.9cM的ISSR分子标记；闫立英(2009)以全雌黄瓜单性结实自交系‘6401’和非单性结实自交系‘6429’为亲本建立F2分离群体，用BSA方法构建单性结实和非单性结实近等基因池，用两池DNA筛选了76个ISSR引物，在单性结实池中扩增出一条分子量约为470bp的特异条带。经F2单株验证，该特异条带能在大多数单性结实单株中稳定出现。用MapMaker3.0软件进行连锁分析表明，该特异带与黄瓜单性结实性存在连锁关系，遗传距离为22.5cM，将连锁标记命名为161470；王鱼等（2011）使用全雌黄瓜单性结实自交系‘6401’和非单性结实自交系‘6429’为亲本建立F2分离群体，用BSA方法构建了单性结实和非单性结实基因池，对共386对SSR引物进行了多态性筛选。对表现多态性的SSR引物在F2群体中进行验证，发现引物SSR22338是与单性结实QTL位点连锁的标记；武喆等（2015）综合重测序、SSR标记、转录组及qRT-PCR研究表明，黄瓜2号染色体上一个QTL区域可能与单性结实性状相关，其中五个基因被初步认定为是候选基因；CalvinD.Lietzow等（2016）在北美加工型黄瓜中利用SSR标记检测到6号和7号染色体上有3个稳定的QTLs。
技术实现思路
本专利技术提供了一个与黄瓜单性结实QTL紧密连锁的InDel标记及其应用与用于扩增上述InDel标记的引物对。本专利技术运用变异组学与群体遗传学的方法获得了与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实品种选育的进程。本专利技术的第一个目的是提供一个与黄瓜单性结实QTL紧密连锁的InDel标记为Chr7InDel01，位于黄瓜第7号染色体4,108,811处。在双亲的Chr7InDel01处，父本（弱单性结实性黄瓜品系）有插入如下碱基：AAAATATTTACCAAAATTT，而母本（强单性结实性黄瓜品系）在此处的碱基仅为A。本专利技术的第二个目的是提供一组用于检测上述与黄瓜单性结实基因相关的InDel标记的引物对，包括Chr7InDel01标记的上游引物5′-TGTTGTTGTTGCTATATGGGTAATG-3′，反向引物5′-CGATAATGACGTGGGTTGTG-3′。本专利技术的第三个目的是公开了所述的InDel标记及其衍生的引物在黄瓜单性结实分子标记辅助育种中的应用：若在Chr7InDel01处有插入碱基‘AAAATATTTACCAAAATTT’的黄瓜品种，为弱单性结实性品种；若在Chr7InDel01处碱基仅为A的黄瓜品种，则为强单性结实性品种。本专利技术所述的应用，具体方法是：1）提取待检测黄瓜基因组DNA；2）以待检测黄瓜基因组DNA为模板，利用Chr7InDel01的引物对进行PCR扩增反应；3）经上述PCR扩增后电泳，如条带与‘ZK’一致，则为弱单性结实性黄瓜品系；如条带与‘BY’一致，则为强单性结实性黄瓜品系。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用变异组学与群体遗传学的方法获得与黄瓜单性结实QTL紧密连锁的InDel标记，通过测序和设计引物的方法检测黄瓜基因型，根据基因型即可判断黄瓜单性结实的强弱，从而加速黄瓜强单性结实性品种选育进程。同时，此InDel标记也将为黄瓜单性结实基因精细定位、克隆和创新种质奠定重要的技术基础。附图说明图1是部分SSR标记在亲本间的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；图1中：P1：弱单性结实性亲本‘ZK’，P2：强单性结实性亲本‘BY’，M为20bpmarker。图2是SSR标记在F2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；图2中：P1：弱单性结实性亲本‘ZK’，P2：强单性结实性亲本‘BY’，其余为F2，M为20bpmarker。图3是InDel标记在亲本间的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；图3中：P1：弱单性结实性亲本‘ZK’，P2：强单性结实性亲本‘BY’，M为20bpmarker。图4是Chr7InDel01在重组株中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图，图4中：M为20bpmarker。图5是InDel标记在F2中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；图5中：P1：弱单性结实性亲本‘ZK’，P2：强单性结实性亲本‘BY’，1至4为弱单性结实性的F2，5至8为强单性结实性的F2，M为20bpmarker。图6是Chr7InDel01在十个黄瓜自交系中的聚丙烯酰胺凝胶电泳多态性检测图；图6中：左边五个为弱单性结实性品系，右边五个为强单性结实性品系，M为20bpmarker。具体实施方式实施例一1遗传分离群体的构建与单性结实率的统计BY（母本），强单性结实性，欧洲温室水果型黄瓜，全雌性，果实短，表皮光滑无刺瘤。ZK（父本），弱单性结实性，华北型黄瓜，全雌性，果实长，表皮有刺瘤。双亲均为扬州大学黄瓜遗传育种与生长发育调控团队自主培育品种，均有留种，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证。本实验案例利用这两个亲本配制杂交组合F1，F1自交产生F2群体，再以‘ZK’为轮回亲本配制回交后代，而后获得F2、BC1、BC2、BC3群体。单性结实率的统计方法为将于第二天开放的雌花进行夹花，避免授粉，五天后统计雌花的单性结实率，每次统计后摘除统计过的果实，以免影响上方节位的果实发育。统计主蔓20节以内的单性结实率。单性结实率=单性结实的果实数量∕夹雌花总数*100%2黄瓜单性结实基因的初步定位2.1黄瓜基因组DNA的提取使用试剂盒法提取黄瓜亲本及F2群体基因组DNA。2.2多态性SSR引物筛选SSR引物来自于Ren等(2009)在PLoSONE上发表的文章《AnIntegratedGeneticAndCytoeneticMapofCucumberGenome》及Cavagnaro等(2010)在BMCGenomics上发表的《Genome-widecharacterizationofsimplesequencerepeatsincucumber(CucumissativusL.)》。SSR的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性45s，68-58℃退火1min（每个循环降低2℃），72℃延伸1min本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，将InDel标记命名为Chr7InDel01；Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处，在双亲的Chr7InDel01处，父本即弱单性结实性黄瓜品系有插入如下碱基：AAAATATTTACCAAAATTT，而母本即强单性结实性黄瓜品系在此处的碱基仅为A。

【技术特征摘要】
1.与黄瓜单性结实基因紧密连锁的InDel标记，将InDel标记命名为Chr7InDel01；Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处，在双亲的Chr7InDel01处，父本即弱单性结实性黄瓜品系有插入如下碱基：AAAATATTTACCAAAATTT，而母本即强单性结实性黄瓜品系在此处的碱基仅为A。2.一组用于检测权利要求1所述与黄瓜单性结实基因相关的InDel标记的引物对，其碱基序列为：上游引物5′-TGTTGTTGTTGCTATATGGGTAATG-3′，反向引物5′-CGATAATGACGTGGGTTGTG-3′。3.权利要求1所述的Chr7InDel01在黄瓜强/弱单性结实性品种鉴定中的应用：Chr7InDel01位于黄瓜第7号染色体4,108,811处；若在Chr7InDel01处有插入碱基‘AAAATATTTACCAAAATTT’的黄瓜品种，为弱单性结实性品种；若在Chr7InDel01处碱基仅为A的黄瓜品种，则为弱单性结实性品种。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1）提取待检测黄瓜基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈学好，何梦晓，许学文，齐晓花，徐强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32