一种ω-转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ω‑转氨酶突变体及其应用，该ω‑转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术ω‑转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillus terreus)ω‑转氨酶77位的异亮氨酸、150位的甲硫氨酸、210位的组氨酸和280位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸获得，该ω‑转氨酶突变体的半失活温度(T50

【技术实现步骤摘要】
一种ω-转氨酶突变体及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种ω-转氨酶突变体及其应用。
技术介绍
手性胺类化合物是具有重要价值的医药及精细化工中间体。目前，超过70％的药物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等都是以手性胺作为中间体来合成的。来自于土曲霉(Aspergillusterreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，PLP)的参与，催化过程如下所示：研究表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其热稳定性有待进一步提高。目前，酶稳定性改造的方法有三种，分别是：非理性设计，理性设计和半理性设计三个方面。其中，基于序列的半理性设计是通过对天然蛋白质序列进行统计学分析，得到的结果用于指导鉴定可能的靶标位点。较常用的方法是对蛋白质进行一致性突变。一致性突变方法认为在同源蛋白质中某一个氨基酸位置，一致的氨基酸比不一致的氨基酸对蛋白质稳定性的平均贡献要高，因此用一致的氨基酸取代不一致的氨基酸，可以提升酶的稳定性。申请公布号为CN107058256A的专利技术专利申请文献公开了一种ω-转氨酶突变体，该突变体获得的方法是利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列，通过Weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证。根据上述方法，该专利技术分别提供了第77位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，或第97位氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸，或第210位氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺，或第245位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸，或第292位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第295位氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸的突变体。此外，二硫键(disulfidebond)是2个巯基被氧化所形成的-S-S-形式的硫原子间的共价键。在蛋白质中，两个半胱氨酸形成二硫键，能够固定蛋白质的三级结构，降低蛋白质解折叠熵，提高蛋白质稳定性。申请公布号为CN105950581A的专利技术专利申请文献公开了一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体，该突变体是由土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得。该突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。虽然，上述突变体与野生型ω-转氨酶相比能够提高半失活温度以及延长半衰期；但是，若要在实际生产中更好地加以应用，上述突变体的半失活温度和半衰期仍有待进一步提高。
技术实现思路
本专利技术通过组合序列一致性突变和引入二硫键的两种不同理性设计方法，实现了ω-转氨酶热稳定性的进一步提高，获得了一个具有极佳热稳定性的ω-转氨酶突变体。首先，本专利技术利用序列一致性突变筛选热稳定高的ω-转氨酶突变体，具体方法如下：(1)利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列；(2)利用Weblogo程序(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点；(3)根据氨基酸残基位点设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点PCR扩增，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；(4)从所述定点突变文库中筛选ω-转氨酶突变体，通过实验确定热稳定性提高的ω-转氨酶突变体(H210N/I77L)。与此同时，根据ω-转氨酶的三维结构模型并分析蛋白质结构中B-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件DisulfidebyDesign(DbD，http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2)以及DisulfideBondsinProteins(MODIP，http://caps.ncbs.res.in/dsdbase/modip.html)对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；在ω-转氨酶突变体H210N/I77L的基础上引入一对额外的二硫键(M150C-M280C)，获得ω-转氨酶突变体(H210N/I77L/M150C/M280C)。所述ω-转氨酶突变体(H210N/I77L/M150C/M280C)的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术又提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。所述的基因，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。ω-转氨酶突变体(H210N/I77L/M150C/M280C)是指ω-转氨酶(来自土曲霉(Aspergillusterreus)，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)的第77位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸、第150位的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸、第210位的氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺以及第280为的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸。本专利技术还提供了包含所述基因的表达单元。本专利技术还提供了包含所述基因的重组载体。重组载体的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子，在这些启动子的作用下，ω-转氨酶突变体可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。重组载体所选用的原始载体可以是常用的用于蛋白表达的载体，比如pET28a。本专利技术还提供了包含所述基因的基因工程菌。本专利技术还提供了包含所述重组载体的基因工程菌。可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上以获得稳定表达所述ω-转氨酶突变体蛋白的重组基因工程菌，也可以是通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌，优选为E.coliBL21(DE3)。本专利技术还提供了所述ω-转氨酶突变体在催化(R)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。手性选择性为(R)型。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术ω-转氨酶突变体由土曲霉(Aspergillusterreus)ω-转氨酶77位的异亮氨酸、150位的甲硫氨酸、210位的组氨酸和280位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度(T5010)为50.3±0.5℃，比野生型提高了11.8℃，在40℃下的半衰期(t1/2)为114.6±2.8min，是野生型的16.6倍，热稳定性显著提高。(2)本专利技术利用NCBI数据库和BLAST软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列，通过Weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证，找到序列一致性突变中热稳定提高最多的突变酶，并在此基础上引入一对额外的二硫键(M150C-M280C)，获得的ω-转氨酶突变体(H210N/I77L/M150C/M280C)；该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。附图说明图1为质粒pET28a(+)-ω-AT的基因图谱。图2为ω本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.ω‑转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.ω-转氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.编码如权利要求1所述ω-转氨酶突变体的基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。4.一种包含如权利要求2或3所述基因的表达单元...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，梅乐和，谢东芳，吕常江，朱婉丽，胡升，赵伟睿，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33