一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针及制备方法、应用技术

本发明专利技术提供一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针及制备方法、应用，所述荧光探针的化学结构如通式I所示：

【技术实现步骤摘要】
一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针及制备方法、应用
本专利技术属于化学分析检测
，涉及有机小分子荧光探针
，具体是涉及一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针及其合成和在检测半胱氨酸方面的应用。
技术介绍
半胱氨酸是一种重要的生物巯基分子，在很多生理过程中起到非常重要的作用，如维持生物氧化还原平衡，参与酶催化反应，螯合重金属离子等。另一方面半胱氨酸体内的含量水平的异常与许多机体功能异常及疾病密切相关，如生长停滞、肌肉萎缩、毛发脱色、肝损伤、心血管疾病等。因此为了更进一步了解半胱氨酸的生理病理功能，开发高灵敏、高选择检测半胱氨酸的方法是非常必要的。传统检测半胱氨酸的方法主要有液相色谱法、毛细管电泳法、电化学方法及比色法。但现有技术中的这些方法一般都耗时较长、涉及复杂繁琐的样品处理过程或需要昂贵的精密仪器等。而利用荧光探针荧光法检测半胱氨酸具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了快速发展与利用。但目前开发的用于检测半胱氨酸的荧光探针分子大都存在灵敏度低、水溶性差等缺点，这样不利于实际生物样品的分析。因此，亟需一种更加灵敏、水溶性好的高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针及制备方法、应用的技术方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述现有技术中不足，提出一种新的易于制备、性能稳定，抗干扰强的高灵敏水溶性荧光荧光探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对半胱氨酸进行高选择性和高灵敏度的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针，所述荧光探针的化学结构如通式I所示：一种如所述的荧光探针的制备方法，制备通式I所示的荧光探针的化学反应式为：所述制备方法包括如下步骤：(1)将所述化学反应式中的香豆素衍生荧光团和2，4-二硝基苯磺酰氯作为原料加入反应器中，并加入有机溶剂进行溶解；溶解后再加入催化剂，置于室温下搅拌、偶联反应一段时间，并检测是否已经完全反应；(2)步骤(1)中的反应完全后，经萃取、分离、纯化，得到目标产物荧光探针。如上所述的制备方法，优选，所述步骤(1)中，采用薄层色谱法检测是否已经完全反应。如上所述的制备方法，优选，步骤(1)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；所述催化剂为三乙胺、二异丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。如上所述的制备方法，优选，步骤(1)中，加入的所述香豆素衍生荧光团、所述2，4-二硝基苯磺酰氯和所述催化剂的摩尔比按照如下比例：香豆素衍生荧光团∶2，4-二硝基苯磺酰氯∶催化剂为1∶1～3∶1～3。如上所述的制备方法，优选，步骤(1)中于室温下搅拌反应时间为0.5-2h。如上所述的制备方法，优选，于室温下搅拌反应时间为1h。如上所述的荧光探针的应用，利用通式I所示的荧光探针对水体及生物体系中的半胱氨酸进行定性或定量测定。如上所述的荧光探针的应用，优选，对水体系中的半胱氨酸进行定性测定的具体是指：采用比色法检测时，将荧光探针加入待测溶液中，溶液从黄色变无色，实现待测溶液中半胱氨酸的定性检测；对水体系中的半胱氨酸进行定量测定的具体是指：采用荧光检测时，将所述荧光探针溶解于水缓冲体系中，加入不同浓度半胱氨酸溶液，测试其在413nm处的荧光强度，然后以溶液在413nm处荧光发射强度对半胱氨酸的浓度作标准图，根据标准图，定量检测半胱氨酸在待测溶液中的含量。如上所述的荧光探针的应用，优选，对生物体系中的半胱氨酸进行检测：利用通式I所示的荧光探针与细胞培养，细胞荧光成像观测到蓝色荧光，用于检测细胞中的半胱氨酸。与最接近的现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下有益效果：本专利技术提供了一种从简单的原料出发，简便、高效、经济性地合成荧光探针的方法。该方法具有操作简单、反应条件温和、环境友好、收率高等优点，且适宜于规模化制备。本专利技术的探针分子原料易得，合成产率较高，达63％以上。且所制备的探针光学性能稳定(探针可室温稳定存放六个月以上，其光谱性质保持不变)，灵敏度较高，对半胱氨酸识别能力强，检测时溶液由黄色变为无色，可实现裸眼识别，且选择性好，响应速度较快(响应时间10min以内)，响应范围为0.1-6μmol·L-1，检测限低(23nM)，因此，本专利技术的技术方案提供的探针可用于水体及生物体系中半胱氨酸的高灵敏检测。附图说明图1为本专利技术具体实施例合成的荧光探针的核磁共振氢谱。图2为本专利技术具体实施例荧光探针与半胱氨酸反应前后的紫外谱图A与荧光光谱图B；其中，A图中：1-反应前，2-反应后；B图中：1-反应前，2-反应后。图3为本专利技术具体实施例10μmol·L-1荧光探针在加入不同浓度半胱氨酸后荧光发射光谱图，从a至m，半胱氨酸浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0、100.0μM，溶液体系为水的混合缓冲溶液(10mM磷酸缓冲液，pH7.4)，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。图4为半胱氨酸的浓度标准曲线图，即10μmol·L-1荧光探针，反应前后在413nm处荧光发射强度和半胱氨酸浓度的线性关系；横坐标为半胱氨酸的浓度，纵坐标为荧光强度。图5为本专利技术具体实施例荧光探针对半胱氨酸选择性；即10μM本专利技术荧光探针，加入100μmol·L-1Cys(半胱氨酸)及其他不同干扰物质AA(抗坏血酸)、Ala(丙氨酸)、Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酰胺)、Gln(谷氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Lys(赖氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Phe(笨丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Ser(丝胺酸)、Thr(苏氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、GSH(谷胱甘肽)后，在413nm处荧光发射强度的变化；横坐标为测试的干扰物质，纵坐标为荧光强度。图6为本专利技术具体实施例探针检测Hela细胞内半胱氨酸的成像图片；(A，B)分别是本专利技术荧光探针(10μmol·L-1)培养的HeLa的明场图片和荧光图片；(C，D)分别是本专利技术荧光探针(10μmol·L-1)和半胱氨酸(100μmol·L-1)培养的Hela细胞的明场图片和荧光图片；标尺：25μm。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。本专利技术提供一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针，本专利技术利用半胱氨酸特有的反应性质，能选择性地巯解2，4-二硝基苯磺酰酯；另一方面基于基于香豆素的骨架结构可开发出含官能团(如羟基)、水溶性好、灵敏度高的荧光团，且通过在酚羟基位引入吸电子基团能改变原荧光骨架的推拉电子体系特性从而改变其荧光性质。基于此，本专利技术设计了一种2，4-二硝基苯磺酰酯为响应基团，香豆素衍生骨架作为发光团的用于检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构如通式I所示：

【技术特征摘要】
1.一种高灵敏检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的化学结构如通式I所示：2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，制备通式I所示的荧光探针的化学反应式为：所述制备方法包括如下步骤：(1)将所述化学反应式中的香豆素衍生荧光团和2，4-二硝基苯磺酰氯作为原料加入反应器中，并加入有机溶剂进行溶解；溶解后再加入催化剂，置于室温下搅拌、偶联反应一段时间，并检测是否已经完全反应；(2)步骤(1)中的反应完全后，经萃取、分离、纯化，得到目标产物荧光探针。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用薄层色谱法检测是否已经完全反应。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的一种或几种；所述催化剂为三乙胺、二异丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入的所述香豆素衍生荧光团、所述2，4-二硝基苯磺酰氯和所述催化剂的摩尔比按照如下比例：香豆素衍生荧光团∶2，4...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝远强，韦秀华，张银堂，瞿鹏，徐茂田，
申请(专利权)人：商丘师范学院，
类型：发明
国别省市：河南,41