一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体公开了一种基于结合原理的高通量药物筛选方法，包括以下步骤：（1）制备带有组氨酸标签的目标蛋白：（2）将待筛选的样品与蛋白孵育；（3）将以上混合物与螯合镍的琼脂糖磁珠结合；（4）磁性分离磁珠，洗脱磁珠表面非特异性的结合物；（5）洗脱目标化合物，用质谱仪器鉴定与目标蛋白结合的小分子。（6）将与目标蛋白有结合作用的小分子进行进一步的生物活性验证。如果待测样品对该蛋白有生物调节的功能，则待测样品为阳性。该方法具有快速、成本低、节省样品量等特点，为发现靶标化合物提供新的筛选方法。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法
本专利技术涉及生物医药领域，涉及一种镍离子螯合琼脂糖磁珠亲和层析原理高通量筛选蛋白配体的方法。专利技术背景传统的小分子抑制剂药物筛选方法是，先将测试的化合物逐一进行生物活性评价。这样的方法所用时间较长，筛选效率低，工作量大，成本高；随后发展的明胶酶谱法、放射性同位素法、高效液相色谱（HPLC）测定法、分光光度法等，各种方法均有相应的缺陷，如放射性同位素法则耗时长，对环境产生污染；HPLC测定法需要大量的流动相和昂贵的色谱柱等。因此开发快速、有效、操作简单和高通量的筛选方法是实现小分子抑制剂的必然趋势。固定化金属螯合亲和层析技术是一种在近几年新发展起来的分离技术，原理是利用目标蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸等均可以与金属离子之间发生特殊的相互作用，如配价键结合等，从而可以把目标蛋白吸附在固定载体上，分离出来，而一般所用到的金属离子有Ni2+，Co2+，Ca2+，Mg2+等，同时金属螯合亲和层析可能的抑制剂具有简单，吸附量大，分离条件温和等特点。磁珠的结构通常由具磁性的内核及核外包裹的高分子外壳两部分组成。由于磁核对外磁场的响应，磁珠可与磁铁吸附。当把磁铁移开，磁珠与磁铁分离。利用这一性质可以将磁珠从周围介质中迅速分离出来。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种微型化、通量高、灵敏度高的筛选蛋白质配体药物的方法。一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法，包括以下步骤：（1）制备带有组氨酸标签的目标蛋白；（2）将待筛选的样品与蛋白孵育；（3）将以上混合物与螯合镍的琼脂糖磁珠结合；（4）磁性分离，洗脱磁珠表面非特异性的结合物；（5）洗脱目标复合物，分子与蛋白结合的小分子，用质谱仪器鉴定与目标蛋白结合的小分子；（6）将与目标蛋白有结合作用的样品进行进一步的生物活性验证。上述步骤（1）中，其中所述亲和标签是His标签。上述步骤（3）中，螯合的金属离子是Ni2+。本专利技术的有益之处在于：本专利技术利用组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠与目标蛋白与筛选物的混合物结合，因而排除掉没有与目标蛋白的结合的小分子。洗脱蛋白与小分子结合复合物，分离小分子，然后将用质谱仪器鉴定目标小分子。最后，采用相应的药理学实验，验证目标小分子对该蛋白酶的活性的影响。如果待测样品对该蛋白有生物调节的功能，则待测样品为阳性。该方法具有快速、成本低、节省样品量等特点，为发现靶标化合物提供新的筛选方法。附图说明图1为基于结合原理高通量筛选蛋白酶配体的方法流程图；图2为正离子模式下固相酶法筛选得到的化合物LC-MS分析结果。图3为HPLC方法对目标小分子的鉴定。图4为二氢丹参酮I对ERp57蛋白酶活性的抑制作用。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂均为市售。筛选的样品，可以是中药提取物或者多个化合物的混合物。本专利中，以中药丹参提取物为例。1.带His标签的ERp57蛋白的制备：加入10ml结合缓冲液悬浮2g湿重的E.coliBL21菌株（已转化构建好的ERp57原核表达质粒[pTriExTM-4Neo/ERp57]），进行破碎和裂解，即为ERp57粗蛋白样品。按照用His-tagProteinPurification磁珠对蛋白进行纯化，经蛋白电泳鉴定纯度后，纯度在90%以上，将蛋白超滤浓缩后，备用。2.丹参提取物的制备：精密称量实验所用药材丹参饮片200g，再用小型的药材粉碎机粉碎，在得到的药材粉末中加入2L（1:10）的75％乙醇，放在黑暗之中浸泡大约12h，在恒温水浴箱60oC时加热1.5h，加热后用纱布过滤，再在滤渣中加入2L的蒸馏水，放入60oC恒温水浴箱加热，大约1.5h后又用纱布过滤，并将两次过滤得到的液体合并在一起，放在旋转蒸发仪上浓缩后得到丹参提取物的浓缩液，最后在冷冻干燥仪将此浓缩液冻干成粉末，备用。3.丹参复合物与ERp57蛋白的结合：将预先制备好的丹参提取物（终浓度：5mg/mL）加入到ERp57蛋白酶溶液（综浓度：1mg/ml）中，在旋转混合仪上，室温混合孵育60min，得到混合物。4.混合物与磁珠的结合：在上述混合物中加入500μl体积螯合镍离子的琼脂糖磁珠，同时在结合缓冲液中加入同等体积的螯合镍离子的琼脂糖磁珠做为空白对照组（无ERp57蛋白），在旋转混合仪上，室温混合孵育90min。5.结合化合物的分离：磁性分离磁珠，使用结合缓冲液洗涤3次，除去非特异性结合物。使用10%乙腈洗脱磁珠上结合的复合物，得到液体混合物。使用3KD的超滤管离心液体混合物，收集滤液，将滤液在冷冻干燥机上冷冻成粉末，称重，备用。该冻干粉，理论上为与目标蛋白有结合的小分子。表1冻干粉的重量（mg）空白磁珠(无ERp57蛋白)实验组磁珠（有ERp57）4.608.506.结合化合物的LC-MS鉴定：将步骤6所的粉末样品溶解在50%甲醇中，配成浓度为1mg/mL的溶液，再用0.22μM的滤膜进行过滤，然后作为供试品溶液备用。LC-MS系统由安捷伦技术1260无限高效液相色谱系统和安捷伦科技6130四极杆LC-MS组成。液相色谱的条件是：安捷伦proshell120EC-C18（3.0×150mm，2.7μM）在30℃，流量是为0.43mL/min，流动相是由0.1%甲酸-水（A）和乙腈（B）两溶剂组成，流动相的梯度为0-20min，17-25%B；20-22min，25-70%B；22-30min，70-78%B；30-31min，78-90％B；31-38min，90%B；38-40min，90-17%B，进样量为10μL，样品的浓度为1mg/mL，溶剂为50%甲醇-水（V/V）。检测的波长为270和286nm。质谱的条件是：以全波段扫描为模型，M/Z是从100到1000Da，电喷雾是在负离子模式下进行，干燥气的温度为350℃，干燥气的流速为10L/min，毛细管的电压为3000V。表2所得化合物的LC-MS结果对比信息保留时间(min)选择离子m/z预测的化合物名称30.87[M+H]+279.2二氢丹参酮I7.结合化合物HPLC的鉴定HPLC分析条件：色谱柱：KromasilC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；二氢丹参酮I的检测波长：254nm，流动相：甲醇-水（6.5:1）。8.所得化合物抑制体外ERp57的活性的测定：通过测定底物胰岛素的浊度来评价ERp57的活性，在此反应体系中，ERp57的终浓度为0.04mg/mL，底物胰岛素的最终浓度是为1mg/mL，胰岛素需要新鲜配制，二氢丹参酮I的最终浓度分别为50，25，12.5，6.25，3.13μM，而且对上述的所有样品都是用缓冲液（100μM磷酸二氢钾，2mMEDTA（PH：7.4）和8μMDTT）进行稀释的。反应在96孔板中进行，分别设立了6个组，分别为背景组（不含ERp57和二氢丹参酮I），模型组（不含二氢丹参酮I），二氢丹参酮I三个剂量组（50，25，12.5，6.25本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法，包括以下步骤：（1）制备带有组氨酸标签的目标蛋白；（2）将待筛选的样品与蛋白孵育；（3）将以上混合物与螯合镍的琼脂糖磁珠结合；（4）磁性分离，洗脱磁珠表面非特异性的结合物；（5）洗脱目标复合物，分子与蛋白结合的小分子，用质谱仪器鉴定与目标蛋白结合的小分子；（6）将与目标蛋白有结合作用的样品进行进一步的生物活性验证。

【技术特征摘要】
1.一种高通量快速筛选ERp57抑制剂的方法，包括以下步骤：（1）制备带有组氨酸标签的目标蛋白；（2）将待筛选的样品与蛋白孵育；（3）将以上混合物与螯合镍的琼脂糖磁珠结合；（4）磁性分离，洗脱磁珠表面非特异性的结合物；（5）洗脱目标复合物，分子与蛋白结合的小分子，用质谱仪器鉴定与目标蛋白结合的小...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔国祯，周鹤峰，师伟，邹佳，毛皓，李惠民，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52