一种检测苔藓虫在污损早期附着程度的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种检测苔藓虫在海洋污损中早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)苔藓虫特异性引物的设计；(2)污损早期不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来定量检测苔藓虫的附着程度。本发明专利技术基于海洋污损真核生物苔藓虫的18S核糖体RNA基因序列设计特异性引物，提供了一种不依赖于纯培养体系的苔藓虫附着测定方法，为海水现场污损样本中苔藓虫的附着程度检测提供了高效、快速的技术手段。同时，该方法也适用于室内纯培养体系中不同涂层表面的苔藓虫附着测定。

【技术实现步骤摘要】
一种检测苔藓虫在污损早期附着程度的方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及在主要的海洋污损生物中对污损早期苔藓虫附着的测定。
技术介绍
苔藓虫、牡蛎等多种附着海洋生物，它们的幼虫或孢子吸附在轮船底部或海洋结构物表面，吸附生长厚度有时可达10公分，给行船额外带来大量能耗，同时释放酸性物质腐蚀船底，这就是海洋生物污损。海洋生物污损给全世界海洋产业的发展带来严重危害，极大程度上限制了人类对于海洋资源的开发和利用，海洋防污成为亟待解决的重要问题。主要的海洋污损生物(macrofouler)是苔藓虫、藤壶、牡蛎、盘管虫、海鞘、某些藻类、贻贝、海绵等。作为海洋污损生物的代表物种之一，苔藓虫属真体腔动物，是海洋底栖动物的重要组成之一，种类多，分布广，常常形成群体，密布在岩壁、鱼网、船底、浮标等物体上，在海洋污损生物中的出现频率很大。尽管国内外已有许多有关海洋防污技术的研究，但是这些发现很多尚没有针对主要的海洋污损生物进行实际的长期的海水实验。相关的防污机制研究、尤其是在分子水平上的深入研究，相对还是非常缺乏。而在世界不同海域不同的船舶所遇到的生物污损问题和程度不尽相同，尤其是污损生物种类繁多，各自附着的分子机制有所不同，很难使用一种或几种防污涂料就能解决所有问题。将来可能陆续需要研制分别针对不同污损生物附着的防污涂层以及组合防污涂层。所以，在细胞和分子生物学水平上对污损生物进行足够的研究就显得非常重要，否则，尽快找到通用的环保型防污技术的可能性将会大大降低。而要完成上述研究任务，一个非常必要的先期任务是建立主要污损生物幼虫在早期污损期间附着程度的定量测定方法。而想要对苔藓虫早期附着时进行测试其附着率，分子标记方法成为首选的技术手段。该方法能够避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子包含的稳定遗传信息，定量描述、分析附着情况，在相当程度上提高了鉴定主要海洋污损早期生物物种的准确度和效率。苔藓虫的附着程度检测至少在如下几个方面非常重要:(1)快速比较一批防污涂层在海洋污损早期抑制苔藓虫附着能力的差异；(2)比较某个涂层在室内苔藓虫纯培养体系中幼虫附着率与实际海水中幼虫附着率的差异。(3)优质涂层抑制海洋污损的机制研究：有时需要测定在某个特定的涂层表面苔藓虫的附着生长被抑制是由于幼虫附着被抑制还是附着后生长被抑制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在海洋污损中对污损早期苔藓虫附着程度进行测定的方法。测定的特异性是由三对苔藓虫特异性引物来保障的，三对特异性引物均基于苔藓虫的18srDNA设计。它们与核糖体模因18srDNA的通用引物一起使用可以确保苔藓虫基因扩增的特异性。扩增结果可以通过qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量测定。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：(1)苔藓虫特异性引物的设计；(2)污损早期(肉眼可见附着之前)海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着程度。苔藓虫特异性引物的设计方法如下：比较主要海洋污损真核生物的18S核糖体基因序列，找出来苔藓虫的特异性SNP(单核苷酸多态性)位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配:A-C,T-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配:T-T,T-C,A-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得苔藓虫特异性引物。通过上述方法设计的三对苔藓虫特异性引物分别为：上述引物与通用引物比如F566:5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’一起使用可以完成早期污损样品中苔藓虫存在与否的测定判断。其中特异性引物Bug1在唇口目(Cheilostomatida)覆盖率较大，特异性引物Bug2是新唇口亚目(Neocheilastomina)特异性引物，特异性引物Bug3是网纱帐苔虫(Conopeumreticulum)的种特异性引物。将设计筛选出的3对苔藓虫特异性引物应用到污损早期不同涂层表面的真核生物群落，依据PCR或qPCR扩增结果及对应引物信息从而定量检测苔藓虫的附着程度。上述有关步骤的具体内容如下：(1)设计苔虫属对应的特异性引物：通过某海水污损样本中18srDNA的扩增(扩增引物为5’-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’和5’-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3’)及克隆测序，获得一批有效克隆,之后进行BLAST生物信息学分析,确认一批污损真核生物(含苔藓虫)的各自的18S序列。很多18S序列也可以通过数据库下载整理得到。通过对上述18S序列的多序列比对和反复比较,找出来苔藓虫的若干个特征性SNP(单核苷酸多态性)位点多个。以这些SNP位点作为引物的3’最末端位置尝试设计引物。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间形成一个错配，与非靶序列也形成一个错配。这样一来，引物与靶序列只有一个3’倒数第二位的错配，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配。扩增长度在100-500碱基以便于用于qPCR(也可以用于一般PCR)。这些引物对经过合成后以苔藓虫18S序列的克隆纯质粒为模板进行PCR验证扩增特异性，以及qPCR验证(要求只扩增出来特异性的条带，Tm值分析只有主带(不含引物二聚体)，确定各对引物的特异性。选出最佳扩增特异性的引物(对)。特异性引物也可以与通用引物配对使用。原则上可以设计出来不止一对最佳引物。因为苔藓虫本身的亚种很多，可以依据丄述方法设计某个或某些特定亚种的特异性引物，也可以设计某类苔藓虫区分特定其他物种(如盘管虫)的特异性引物。最佳引物对之一为Bug1F:5’-CGGCACGAACACTGTTATGACA-3’与通用引物F566:5’-GGCATCACAGACCTGTTATTGC-3’使用，扩增出来的产物(400左右碱基对)经过DNA测序证明全部为苔藓虫18S序列。经过查阅资料，获知苔藓虫的分类信息，见表格1。表1苔藓虫分类信息经过分析，设计筛选出的3对苔藓虫特异性引物可针对不同的苔藓虫层级。特异性引物Bug1在唇口目(Cheilostomatida)覆盖率较大，特异性引物Bug2是新唇口亚目(Neocheilastomina)特异性引物，特异性引物Bug3是网纱帐苔虫(Conopeumreticulum)的种特异性引物。(2)污损早期(肉眼可见附着之前)海水污损样本的采集和(宏)基因组提取：适用于海上现场取样或室内纯培养体系中的污损样本取样。海上早期污损样本的现场采集和宏基因组提取可采用热酚氯仿抽提法，其具体步骤为：1)将污损样品在海上(现场)刮下来约200微升，内含各种海洋生物及附着的苔藓虫(纯培养体系中就只有苔藓虫)，添加600微升饱和酚(pH8)，剧烈震荡一分钟，带回实验室。2)75℃水浴震荡10分钟后，室温静置3min，10000r/min离心10min；3)吸取上原清液至新EP管中并加入等体积酚，剧烈震荡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测苔藓虫幼虫早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)苔藓虫特异性引物的设计(2)污损早期，海水污损样本的采集和基因组的提取。(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着情况。

【技术特征摘要】
1.一种检测苔藓虫幼虫早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)苔藓虫特异性引物的设计(2)污损早期，海水污损样本的采集和基因组的提取。(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着情况。2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：苔藓虫特异性引物设计方法如下：比较主要海洋污损生物的18S核糖体基因序列，找出苔藓虫的特异性单核苷酸多态性位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配:A-C,T-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配:T-T,T-C,A-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得苔藓虫特异性引物。3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所设...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艾涵，谷庆泽，张治洲，高珊，刘作霖，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学威海，
类型：发明
国别省市：山东,37