使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法技术

技术编号:19583421 阅读:179 留言:0更新日期:2018-11-28 01:59
提高用于纯化蛋白质的下游层析步骤的效率的方法,其包括:(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与所述多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;(b)过载所述离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;(c)从所述离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;(d)使包含所述目的多肽的膜流出物进行与前述膜带相似电荷的纯化步骤,和(e)从所述带电荷的离子交换层析纯化步骤的流出物中回收纯化的多肽。

【技术实现步骤摘要】
使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法本申请是申请日为2012年12月18日的、专利技术名称为“使用离子交换膜层析改进下游蛋白质纯化步骤的方法”的中国专利申请201280070369.9(PCT/US2012/070373)的分案申请。专利
本专利技术一般地涉及蛋白质纯化。特别地,本专利技术涉及通过使用上游离子交换膜层析改进下游纯化步骤的性能以除去杂质的方法。专利技术背景对于生物技术产业而言,蛋白质的大规模经济纯化是日益重要的问题。通常,使用真核或原核细胞系,通过细胞培养产生蛋白质,通过插入含该蛋白质的基因的重组质粒来改造所述真核或原核细胞系以产生目的蛋白。必须使用含糖、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基培养这些细胞,所述生长因子通常由动物血清制备物提供。从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质以达到足够用于人类治疗的纯度是一种艰难的挑战。从细胞碎片中纯化蛋白质的方法最初取决于表达给定蛋白质的机制。一些蛋白质可从细胞中直接分泌到周围的生长培养基中;其他蛋白质则在细胞内产生。对于后一种蛋白质而言,纯化方法的第一个步骤涉及细胞的裂解,其可以通过多种方法完成,所述方法包括机械剪切、渗透压休克或者酶处理。此种破坏将细胞的全部内含物释放到匀浆中,并另外地产生了由于其体积小而难以除去的亚细胞片段。这些通常通过差速离心或者通过过滤除去。在蛋白质产生进行期间,由于细胞自然死亡而直接分泌的蛋白质以及释放的胞内宿主细胞蛋白质造成了相同的问题,尽管量较少。一旦获得了含目的蛋白且没有大细胞碎片组分的澄清溶液,通常使用不同层析技术的组合,尝试将目的蛋白与通过细胞产生的剩余的其他蛋白质分离。这些技术基于蛋白质和其他杂质的电荷、疏水程度或大小来分离蛋白质和其他杂质的混合物。对于这些技术中的每一种,都可采用数种不同的层析树脂,其允许精确地制定所涉及的特定蛋白质的纯化方案。这些分离方法的本质是使蛋白质以不同的速率沿长的柱子向下移动,实现物理分离,该物理分离随着它们进一步通过柱子而不断加大,或者与分离介质选择性粘附,然后通过不同的溶剂或置换剂差异洗脱或者置换所述蛋白质。在一些实例中,当杂质特异地与柱子粘附,并且目的蛋白不与柱子粘附时,即目的蛋白存在于“流通液”中,目的蛋白即可与杂质分离开来。涉及蛋白质纯化的文献包括Fahrner等人,BiotechnolGenetEngRev.2001;18:301-27。一般用于抗体的大规模纯化方法通常建立在作为初级捕获和纯化步骤的固定化A蛋白与其他柱操作组合的应用。A蛋白是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的细胞壁蛋白,对IgG的Fc区具有亲和力。为此,将其广泛地用于IgG纯化。A蛋白柱操作通常实现了98%以上的产物相关纯度,其中在流通液级分中洗掉了大多数处理杂质(processimpurity)。然而,使用A蛋白层析存在很多缺点。首先,通常在中性至弱碱性pH进行结合,并且通常在酸性pH洗脱。一个潜在的问题是低pH可以变性或者部分变性IgG。为此以及由于临床应用需要的高产物纯度,还需要其他浓缩和纯化步骤来分离产物相关的异构体以及除去残留量的宿主细胞蛋白/DNA、细胞培养杂质、浸出的A蛋白和病毒。一个复杂的问题是这些杂质中的许多可以干扰用于分离纯化的抗体的下游处理操作装置的效率。另一主要问题是费用;A蛋白柱比常规离子交换柱贵得多。最后,当A蛋白层析不合适或者费用过高时,例如在纯化多肽、抗体样分子、抗体片段和/或纯化来自某些细胞系统的完全抗体的情况下存在许多方案。本专利技术的特性处理了以上已鉴定的问题,并且在本专利技术的实施方案中展示了当前本领域在抗体、抗体片段和多肽纯化中使用A蛋白步骤的这一方法的备选纯化方法。专利技术概述在本文中,本专利技术涉及提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致膜与多肽以及至少一种污染物结合,(b)从离子交换膜收集包含目的多肽的级分,(c)使包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,和(d)从洗脱液中回收纯化的多肽。在一个备选方案中,本专利技术涉及提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阳离子交换膜,其中多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有低于多肽pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致膜与多肽以及至少一种污染物结合,(b)收集来自离子交换膜的包含目的多肽的级分,(c)使包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,和(d)从洗脱液中回收纯化的多肽。在另一备选方案中,本专利技术涉及提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阴离子交换膜,其中多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有高于多肽的pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致膜与多肽以及至少一种污染物结合,(b)收集来自离子交换膜的包含目的多肽的级分,(c)使包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,和(d)从洗脱液中回收纯化的多肽。在一个方面,污染物是中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)。在另一方面,污染物是大肠杆菌蛋白(ECP)。在另一方面,污染物是庆大霉素。在另一方面,污染物是聚乙烯亚胺(PEI)。在一个方面,多肽包含CH2/CH3区。在另一方面,多肽是抗体。又在另一方面,抗体是单克隆抗体。在其他方面,该方法进一步包括在上述步骤a至b之前、期间或之后,将包含多肽的组合物进行一个或多个另外的纯化步骤,在一个备选方案中,该纯化步骤是Fc-结合的亲和层析(例如,A蛋白层析)以及在另一备选方案中的离子交换层析,其使用以结合/洗脱、流通或置换模式操作的柱子或膜。又在另一方面中,用单块过滤器(monolithfilter)或者厚度过滤器替换离子交换膜。另外,本专利技术通过将纯化的多肽与可药用载体组合,提供了药物组合物的制备。附图简述图1.在存在或不存在最初的A蛋白柱的情况下,通过使用保护CEX柱的CEX膜纯化抗体的示意图。图2.使用保护CEX柱的CEX膜作为最初步骤纯化非抗体的示意图。图3.在MustangTMS(小规模,0.18mLMV,667MV/小时),pH5.5和6.4mS/cm以及pH8.0和5.0mS/cm时的mAb1阴离子交换池的产率。图4.在MustangTMS(小规模,0.35mLMV,600MV/小时),pH8.0时的mAb2阳离子交换池的产率。图5.在MustangTMS(小规模,0.18mLMV,1333MV/小时),pH5.5,3.2mS/cm时的mAb3A蛋白池的CHOP清除率。图6.过载CEX膜后杂质的清除率。图7.通过梯度洗脱测定的并且对每一级分中最高种类浓度归一化的多种种类的MustangS结合强度。图8.通过合计全部梯度洗脱级分质量计算的并在不同膜装载密度比较的,并且对最大质量归一化的多种种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.提高用于纯化蛋白质的下游层析步骤的效率的方法,其包括:a.在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与所述多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;b.过载所述离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;c.从所述离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;d.使包含所述目的多肽的膜流出物进行与前述膜带相似电荷的离子交换层析步骤,和e.从带电荷的离子交换层析步骤的流出物中回收纯化的多肽。

【技术特征摘要】
2011.12.22 US 61/579,2851.提高用于纯化蛋白质的下游层析步骤的效率的方法,其包括:a.在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有足以与所述多肽的pI区分开来以增加所述多肽的电荷的pH和有效防止缓冲液离子屏蔽电荷的低离子强度,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;b.过载所述离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;c.从所述离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;d.使包含所述目的多肽的膜流出物进行与前述膜带相似电荷的离子交换层析步骤,和e.从带电荷的离子交换层析步骤的流出物中回收纯化的多肽。2.权利要求1的方法,其中所述离子交换膜具有0.1至100μm的孔径。3.权利要求1的方法,其中用单块过滤器或厚度过滤器替换所述离子交换膜。4.提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括:(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阳离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相反的电荷,所述缓冲液具有低于所述多肽pI约1至约5个pH单位的pH和≤约40mS/cm的电导率,所述操作条件导致所述膜与所述多肽以及至少一种污染物结合;b.过载所述阳离子交换膜,以使所述至少一种污染物仍与所述膜结合,而所述目的多肽主要在流出物中;c.从所述阳离子交换膜收集包含所述目的多肽的流出物;d.使包含所述目的多肽的膜流出物进行阳离子交换层析纯化步骤,和e.从所述阳离子交换层析纯化步骤的流出物中回收纯化的多肽。5.权利要求4的方法,其中所述pH低于所述多肽的pI约1至约4个pH单位。6.权利要求4的方法,其中所述pH低于所述多肽的pI约1至约3个pH单位。7.权利要求4的方法,其中所述pH低于所述多肽的pI约1至2个pH单位。8.权利要求4的方法,其中所述pH对于所述多肽的pI约1个pH单位。9.权利要求4的方法,其中所述电导率为≤约20mS/cm。10.权利要求4的方法,其中所述电导率为≤约10mS/cm。11.权利要求4的方法,其中所述阳离子交换膜是阳离子交换单块过滤器或厚度过滤器。12.提高用于蛋白质纯化的下游层析步骤的效率的方法,其包括:(a)在包含缓冲液的操作条件下,使包含目的多肽和多种污染物的组合物通过阴离子交换膜,其中所述多肽和膜具有相...

【专利技术属性】
技术研发人员:J·J·小比尔A·M·布朗C·J·多德B·E·塞耶
申请(专利权)人:弗·哈夫曼拉罗切有限公司
类型:发明
国别省市:瑞士,CH

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